Tradicionalne dijagnostičke strategije za otkrivanje infektivnih bolesti zahtijevaju korištenje stolnih instrumenata koji nisu prikladni za testiranje na licu mjesta (POCT).Nova mikrofluidika je visoko minijaturizirana, automatizirana i integrirana tehnologija koja je potencijalna alternativa tradicionalnim metodama za brzu, jeftinu i preciznu dijagnostiku na licu mjesta.Metode molekularne dijagnostike se široko koriste u mikrofluidnim uređajima kao najefikasnije metode za detekciju patogena.Ovaj pregled rezimira nedavna dostignuća u mikrofluidnoj molekularnoj dijagnostici zaraznih bolesti kako iz akademske tako i iz industrijske perspektive.Prvo, opisujemo tipičnu obradu nukleinskih kiselina na čipu, uključujući prethodnu obradu uzorka, amplifikaciju i očitavanje signala.Zatim se upoređuju karakteristike, prednosti i nedostaci četiri tipa mikrofluidnih platformi.Zatim ćemo razgovarati o upotrebi digitalnih testova za apsolutnu kvantifikaciju nukleinskih kiselina.I klasični i noviji komercijalni uređaji za molekularnu dijagnostiku bazirani na mikrofluidima sažeti su kao dokaz trenutnog stanja na tržištu.Na kraju, predlažemo buduće pravce mikrofluidne dijagnostike zaraznih bolesti.
Zarazne bolesti uzrokuju patogeni, uključujući bakterije, viruse i parazite, koji su rasprostranjeni po cijelom svijetu.Za razliku od drugih bolesti, patogeni se brzo inficiraju i šire između ljudi i životinja domaćina putem inokulacije, zraka i vode [1].Prevencija zaraznih bolesti je kritična kao mjera javnog zdravlja.Tri glavne strategije za borbu protiv zaraznih bolesti: (1) kontrola izvora infekcije;(2) prekid prenosnog puta;(3) zaštita osjetljivih populacija.Među glavnim strategijama, kontrola izvora infekcije smatra se najvažnijom strategijom zbog svoje pogodnosti i niske cijene.Brza dijagnoza, izolacija i liječenje zaraženih osoba su kritični i zahtijevaju brze, osjetljive i precizne dijagnostičke strategije [2].Trenutna dijagnoza zaraznih bolesti obično kombinuje klinički pregled zasnovan na znakovima i simptomima i laboratorijske studije kao što su kultura ćelija i molekularna dijagnostika, koje zahtevaju obučeno osoblje, radno intenzivne procedure i skupu opremu za testiranje [3, 4].Prevencija izbijanja zaraznih bolesti zahtijeva brzu, jeftinu i preciznu lokalnu dijagnozu, posebno u područjima s ograničenim resursima gdje su zarazne bolesti česte i teške [5], kao i liječenje u divljini ili na bojnom polju, gdje su hitni slučajevi nepredvidivi..medicinska njega je ograničena [6].U ovom kontekstu, mikrofluidika je tehnologija koja kombinuje tehnologije mikroelektromehaničkih sistema, nanotehnologiju ili nauku o materijalima za preciznu manipulaciju fluidima [7,8,9,10], pružajući nove mogućnosti za detekciju na licu mesta (POCT).) infektivni agensi izvan bolnica i laboratorija.U poređenju sa tradicionalnom dijagnostikom koja oduzima mnogo vremena, mikrofluidna tehnologija nudi uštedu uzoraka i troškova za molekularnu dijagnostiku tokom izbijanja bolesti.Globalno širenje bolesti korona virusa 2019. (COVID-19) uzrokovano je teškim akutnim respiratornim sindromom korona virus 2 (SARS-CoV-2), pa se ponovo ističe važnost mikrofluidike za pravovremenu prevenciju i kontrolu pandemije [11, 12 , 13].Za razliku od tradicionalne dijagnostike, mikrofluidni POCT koristi male prijenosne uređaje u rasponu od stolnih analizatora do malih bočnih test traka za testiranje blizu točke uzorkovanja [14].Ovi testovi sadrže pojednostavljenu pripremu uzorka ili nikakvu pripremu uzorka, brzo pojačanje signala i osjetljiva očitavanja signala što rezultira kratkim trajanjem i preciznim rezultatima u roku od nekoliko minuta.Dostupnost i masovna proizvodnja zdravstvenih instrumenata zasnovanih na mikrofluidima proširili su njihovu isplativu i direktnu dijagnostičku primjenu izvan bolnice, u blizini pacijenata, pa čak i kod kuće.
Među postojećim strategijama za dijagnosticiranje infektivnih bolesti, molekularna dijagnostika je jedna od najosjetljivijih [15, 16].Osim toga, molekularna dijagnostika se često koristi kao zlatni standard za kontinuirano otkrivanje COVID-19, omogućavajući direktnu detekciju virusa specifičnih regija RNK ili DNK prije početka imunološkog odgovora [17, 18].U ovom pregledu predstavljamo najnovija dostignuća u molekularnim dijagnostičkim procesima zasnovanim na mikrofluidima za zarazne bolesti, od akademske do budućih industrijskih perspektiva (slika 1).Počećemo sa tri ključna koraka u detekciji nukleinske kiseline: predtretman uzorka na čipu, amplifikacija nukleinske kiseline i očitavanje signala.Zatim smo uporedili različite tipove mikrofluidnih platformi sa njihovom strukturom i funkcijom, pokazujući jedinstvene karakteristike (snage i slabosti).Digitalna detekcija nukleinskih kiselina se dalje raspravlja i daje kao primjer tehnologije treće generacije za apsolutnu kvantifikaciju molekula infektivnih patogena.Osim toga, bit će predstavljeno nekoliko tipičnih i najnovijih komercijalnih POCT uređaja kako bi se prikazalo trenutno stanje mikrofluidnog POCT tržišta za molekularnu dijagnostiku.Također ćemo razgovarati i objasniti našu viziju za buduće primjene.
Moduli mikrofluidnih čipova za detekciju nukleinskih kiselina mogu se podijeliti u tri kategorije (uzorkovanje, prepoznavanje i signalizacija) prema njihovim funkcijama [19].Među ovim modulima, modul uzorkovanja uglavnom realizuje lizu uzorka i ekstrakciju nukleinske kiseline.Senzorski modul uglavnom kontrolira konverziju i pojačavanje signala nukleinskih kiselina.Modul za signalizaciju detektuje signal konvertovan i obrađen od strane senzorskog modula.Na osnovu procesa detekcije nukleinskih kiselina na čipu, sumiraćemo različite čipove koji mogu realizovati funkciju „ulaz i izlaz“.
Prvi korak u detekciji nukleinske kiseline je ekstrakcija nukleinske kiseline, tj. izolacija ciljne nukleinske kiseline iz originalnog uzorka.Ekstrakcija nukleinske kiseline se izvodi radi pročišćavanja nukleinskih kiselina od drugih molekularnih kontaminanata, osiguravanja integriteta primarne strukture molekula nukleinske kiseline i optimizacije rezultata.Ekstrakcija nukleinske kiseline zahtijeva neophodnu lizu uzorka i hvatanje nukleinske kiseline, čiji kvalitet i efikasnost imaju veliki utjecaj na rezultate istraživanja i dijagnostike.Bilo koji suptilni neželjeni efekti tokom ekstrakcije mogu ograničiti dalje otkrivanje.Na primjer, metode lančane reakcije polimeraze (PCR) i petlje izotermne amplifikacije (LAMP) su inhibirane nekim zaostalim organskim otapalima kao što su etanol i izopropanol u reagensima za izolaciju nukleinske kiseline [20].Ekstrakcija tekućina-tečnost i ekstrakcija čvrste faze su najpopularnije metode za izolaciju nukleinskih kiselina [21], međutim, ekstrakcija tekućina-tečnost na čipu je izuzetno ograničena, budući da reagensi koji se koriste u ekstrakciji tekućina-tečnost uzrokuju koroziju većine mikrofluidnih čipova. .Ovdje ističemo metode ekstrakcije čvrste faze bazirane na mikromrežu i upoređujemo njihove prednosti i nedostatke.
Silicijum je supstratni materijal kompatibilan sa nukleinskim kiselinama zbog svoje biokompatibilnosti, stabilnosti i lakoće modifikacije [22].Važno je da kada se modificira sa silicijum dioksidom ili drugim materijalima, ovaj kompozit pokazuje svojstva da adsorbira negativno nabijene nukleinske kiseline pod niskim pH, visokim uvjetima soli dok eluira s visokim pH, niskim otopinama soli.Na osnovu ovog fenomena moguće je pročistiti nukleinsku kiselinu.
Različiti oblici materijala na bazi silicijum-dioksida su korišteni za ekstrakciju nukleinske kiseline u mikrofluidima, kao što su zrnca silicijevog dioksida, praškovi, filteri od mikrovlakana i membrane od silicijum dioksida [23, 24, 25, 26].Ovisno o svojstvima materijala, materijali na bazi silicija mogu se koristiti u mikro krugovima na različite načine.Na primjer, granule silicijevog dioksida, praškovi i komercijalni nanofilteri mogu se jednostavno staviti u pore ili mikrokanale mikrofluidnih čipova i pomoći u ekstrakciji nukleinskih kiselina iz uzoraka [27, 28, 29].Površinski modificirane silicijumske membrane se također mogu koristiti za brzo pročišćavanje DNK od patogena po niskoj cijeni.Na primjer, Wang et al.[30] Kombinacijom reakcija denaturacije amplifikacije sa lančanom izmjenom posredovanom vezikula sa silicijum membranama obloženim hitozanskim oligosaharidima, uveden je svestrani prijenosni sistem koji je uspješno detektirao 102-108 jedinica koje formiraju kolonije.(CFU)/ml Vibrio parahaemolyticus., a prisustvo virusa je bilo lako vidljivo.Powell et al.[31] Mikromreži na bazi silikona su zatim korišteni za otkrivanje virusa hepatitisa C (HCV), virusa ljudske imunodeficijencije (HIV), Zika virusa i humanog papiloma virusa i automatskog razmnožavanja, u kojem je razvijen vijugavi mikroreaktor od 1,3 μl za hvatanje RNA virusa.i vrši in situ pojačanje.Pored ovih metoda, površinski modifikovane mikrokolone silicijum dioksida takođe igraju ključnu ulogu u ekstrakciji nukleinske kiseline, jer geometrija i svojstva materijala za modifikovanje uveliko povećavaju efikasnost ekstrakcije.Chen et al.[32] je predložio mikrofluidnu platformu za izolaciju RNK niske koncentracije na bazi silicijumskih mikrokolona obloženih aminokiselinama.Ovaj mikrofluidni uređaj integriše niz od 0,25 cm2 mikrostubova na silikonskoj podlozi kako bi se postigla veća efikasnost ekstrakcije kroz dizajn omjera velike površine i zapremine.Prednost ovog dizajna je da mikrofluidni uređaj može postići efikasnost ekstrakcije nukleinske kiseline do 95%.Ove strategije zasnovane na silicijumu pokazuju vrednost brzo izolovanih nukleinskih kiselina po niskoj ceni.U kombinaciji sa mikrofluidnim čipovima, strategije ekstrakcije na bazi silicijuma mogu ne samo povećati efikasnost detekcije nukleinskih kiselina, već i olakšati minijaturizaciju i integraciju analitičkih uređaja [20].
Metode magnetske separacije koriste magnetne čestice za izolaciju nukleinskih kiselina u prisustvu vanjskog magnetnog polja.Često korištene magnetne čestice uključuju Fe3O4 ili γ-Fe2O3 magnetne čestice obložene silicijumom, amino i karboksilom [33,34,35,36].Prepoznatljiva karakteristika magnetnih čestica u poređenju sa SPE metodama zasnovanim na silicijumu je lakoća manipulacije i kontrole sa spoljnim magnetima.
Koristeći elektrostatičku interakciju između nukleinskih kiselina i silicijum dioksida, u uslovima visoke soli i niskog pH, nukleinske kiseline se adsorbuju na površini magnetnih čestica obloženih silicijumom, dok se u uslovima niske soli i visokog pH molekule mogu isprati. opet..Magnetne kuglice obložene silicijumom omogućavaju ekstrakciju DNK iz uzoraka velike zapremine (400 μL) pomoću magnetno kontrolisanog kretanja [37].Kao demonstraciju, Rodriguez-Mateos et al.[38] koristili su magnete koji se mogu podesiti za kontrolu prijenosa magnetnih perli u različite komore.Na osnovu magnetnih čestica obloženih silicijumom, 470 kopija/mL SARS-CoV-2 genomske RNK može se izdvojiti iz uzoraka otpadne vode za detekciju reverzne transkripcije LAMP (RT-LAMP) i odgovor se može očitati u roku od 1 sata.golim okom (slika 2a).
Uređaji na bazi magnetnih i poroznih materijala.Konceptualni dijagram mikrofluidnog uređaja IFAST RT-LAMP za detekciju SARS-CoV-2 RNK (prilagođeno iz [38]).b Centrifugalni mikro uređaj za dSPE nukleinske kiseline bukalnog brisa (prilagođeno iz [39]).c Ugrađeni koncentrator uzoraka koji se samostalno napaja pomoću FTA® kartice (prilagođeno iz [50]).d Fusion 5 filter papir modificiran hitozanom (prilagođeno iz [51]).SARS-CoV-2 teški akutni respiratorni sindrom coronavirus 2, RT-LAMP izotermna amplifikacija posredovana petljom reverzne transkripcije, tehnološki partneri FTA finders, NA nukleinska kiselina
Pozitivno nabijene magnetne čestice idealne su za pričvršćivanje fosfatne kičme nukleinske kiseline.Pri određenoj koncentraciji soli, negativno nabijene fosfatne grupe nukleinskih kiselina mogu biti pozitivno nabijene na površini magnetskih kompozitnih čestica.Stoga su za ekstrakciju nukleinskih kiselina razvijene magnetne nanočestice s hrapavom površinom i velikom gustoćom amino grupa.Nakon magnetne separacije i blokiranja, magnetne nanočestice i DNK kompleksi mogu se direktno koristiti u PCR-u, što eliminira potrebu za složenim i dugotrajnim operacijama pročišćavanja i eluiranja [35].Magnetne nanočestice obložene negativnim karboksilnim grupama također su korištene za odvajanje nukleinskih kiselina adsorbiranih na površinama u visokoj koncentraciji polietilen glikola i otopina natrijevog klorida [36].Sa ovim površinski modificiranim magnetnim perlama, ekstrakcija DNK je kompatibilna s naknadnim amplifikacijom.Dignan et al.[39] opisali su automatiziranu i prenosivu centrifugalnu mikrofluidnu platformu za predtretman nukleinskim kiselinama, omogućavajući netehničkom osoblju da je koristi na licu mjesta.Pored toga, kompatibilnost izolovane DNK sa LAMP-om, metodom koja je dobro prilagođena za analizu nukleinskih kiselina na mestu lečenja, dodatno demonstrira minimalne zahteve za opremom i prikladnost za kolorimetrijske testove (slika 2b).
Metode magnetnih kuglica nude mogućnost automatizirane ekstrakcije, od kojih neke postoje u komercijalnim automatiziranim ekstraktorima nukleinskih kiselina [KingFisher;ThermoFisher (Waltham, MA, SAD), QIAcube® HT;CapitalBio (Peking, Kina) i Biomek®;Beckman (Majami, SAD).), Florida, SAD)].Prednosti kombinovanja magnetnih kuglica sa mikrofluidikom mogu se koristiti za efikasnu automatizovanu ekstrakciju nukleinskih kiselina, što bi potencijalno moglo unaprediti razvoj molekularne dijagnostike;međutim, kombinacija magnetnih perli sa mikrofluidikom i dalje se u velikoj meri oslanja na složene sisteme kontrole za preciznu manipulaciju magnetnim perlama, što objašnjava popularnost komercijalnih proizvoda koji su glomazni i skupi, što ograničava dalju primenu magnetnih perli u POCT.
Nekoliko poroznih materijala kao što su modificirani nitrocelulozni filteri, kartice Finders Technology Associates (FTA), filter papiri na bazi polietersulfona i materijali obloženi glikanom također su korišteni za detekciju nukleinskih kiselina [40, 41, 42, 43, 44].Porozni vlaknasti materijali poput vlaknastog papira prvi put su korišteni za izolaciju DNK fizičkim preplitanjem dugolančanih molekula DNK s vlaknima.Male pore dovode do jakog fizičkog ograničenja molekula DNK, što pozitivno utiče na ekstrakciju DNK.Zbog različite veličine pora vlaknastog papira, efikasnost ekstrakcije ne može zadovoljiti potrebe DNK amplifikacije [45, 46].FTA kartica je komercijalni filter papir koji se koristi u oblasti sudske medicine i široko se koristi u drugim oblastima molekularne dijagnostike.Korišćenjem celuloznog filter papira impregniranog raznim hemikalijama za lizu ćelijskih membrana u uzorku, oslobođena DNK je zaštićena od razgradnje do 2 godine.Nedavno je razvijen impregnirani papir od celuloze za molekularnu detekciju različitih patogena, uključujući SARS-CoV-2, lišmanijazu i malariju [47,48,49].HIV se u izolovanoj plazmi direktno lizira, a virusna nukleinska kiselina je obogaćena FTA® protočnom membranom ugrađenom u koncentrator, što omogućava efikasnu proizvodnju nukleinske kiseline [50] (Sl. 2c).Glavni problem sa detekcijom nukleinske kiseline pomoću FTA kartica je taj što hemikalije kao što su gvanidin i izopropanol inhibiraju naknadne reakcije amplifikacije.Da bismo riješili ovaj problem, razvili smo Fusion 5 hitozanom modificiran filter papir, koji kombinuje prednosti i fizičkog preplitanja molekula DNK i vlaknastog filter papira, i elektrostatičke adsorpcije DNK na hitozanom modificiranim spojevima kako bi se postigla visoko efikasna ekstrakcija nukleinske kiseline. ..filterska vlakna [51] (slika 2d).Slično, Zhu et al.[52] demonstrirali su hitozanom modifikovanu PCR metodu zasnovanu na in situ kapilarnom mikrofluidnom sistemu za brzu izolaciju i detekciju RNK virusa Zika.Nukleinske kiseline se mogu adsorbirati/desorbirati u mješovitom lizatu/PCR mediju, respektivno, na osnovu svojstva hitozana za uključivanje/isključivanje.uključeno i isključeno”, reagira na pH.
Kao što je gore pomenuto, ove strategije kombinuju prednosti različitih materijala čvrste faze i povećavaju efikasnost ekstrakcije nukleinske kiseline u mikrofluidici.U praktičnim primjenama, upotreba ovih materijala u velikim količinama je neekonomična, a pravilna površinska obrada ili površinska modifikacija uobičajenih materijala sa ovim materijalima također može očuvati njihovu funkciju.Stoga se vjeruje da implementacija ovih strategija nakon pilot studije može smanjiti troškove.
Testiranje nukleinske kiseline na mikrofluidnim platformama često koristi male zapremine uzoraka (< 100 µl), stoga zahtijeva pojačavanje ciljnih nukleinskih kiselina sa specifičnim sondama za konverziju u signal koji je zgodan za nizvodno detekciju (optičko, električno i magnetsko) [53, 54]. Testiranje nukleinske kiseline na mikrofluidnim platformama često koristi male zapremine uzoraka (< 100 µl), stoga zahtijeva pojačavanje ciljnih nukleinskih kiselina sa specifičnim sondama za konverziju u signal koji je zgodan za nizvodno detekciju (optičko, električno i magnetsko) [53, 54]. Za testiranje nukleinskih kiselina na mikrožidkostičnim platformama često se koriste nevelike zapremine obrazova (< 100 mkl), stoga je potrebno pojačanje cele nukleinske kiseline pomoću specijalnih zona za pretvaranje signala, pogodnih za naknadno otkrivanje (optičkog, električnog i magnetnog) [53, 54]. Prilikom testiranja nukleinskih kiselina na mikrofluidnim platformama često se koriste male količine uzoraka (<100 µL), pa je potrebno pojačavanje ciljne nukleinske kiseline posebnim sondama da bi se ona pretvorila u signal pogodan za naknadnu detekciju (optički, električni i magnetski) [53, 54].微流控 平台 上 的 核酸 检测 通常 使用 小样 小样 (<100 μl), 因此 需要 使用 特定 探针 扩增 目标 核酸, 以 转换 为 下游 检测 (光学, 电学 和 磁学) 的 信号 [53, 54 ]。微流控 平台 上 的 核酸 检测 使用 小样本 ((<100 μl), 因此 需要 特定 探针 扩增 目标, 以 转换 为 下游 下游 (光学, 电学 磁学) 的 信号 [53, 54, 54, 54 ]。 Obnavljanje nukleinskih kiselina na mikrožidkostičnim platformama obično koristi nevelike zapremine obrazova (<100 mkl), što zahtijeva pojačavanje cjelinih nukleinskih kiselina uz pomoć specijalnih zona za pretvaranje u signale za naknadno otkriće (optičko, električno i magnetno) [53, 54]]. Detekcija nukleinskih kiselina na mikrofluidnim platformama obično koristi male zapremine uzoraka (<100 μl), što zahtijeva pojačavanje ciljnih nukleinskih kiselina posebnim sondama kako bi se pretvorile u signale za naknadnu detekciju (optičke, električne i magnetske) [53, 54]] .Amplifikacija nukleinske kiseline u mikrofluidici također može ubrzati reakcije, optimizirati granice detekcije, smanjiti zahtjeve za uzorkom i poboljšati tačnost detekcije [55, 56].Posljednjih godina, realizacijom brze i precizne detekcije, u mikrofluidici se primjenjuju različite metode amplifikacije nukleinskih kiselina, uključujući PCR i neke izotermne reakcije amplifikacije.Ovaj odjeljak će sumirati metode za detekciju nukleinske kiseline zasnovane na mikrofluidnim sistemima.
PCR je simulacija procesa replikacije DNK organizma, čija je teorija detaljno opisana na drugom mjestu i ovdje se neće raspravljati.PCR može pojačati vrlo malu količinu ciljne DNK/RNA eksponencijalnom brzinom, što PCR čini moćnim alatom za brzo otkrivanje nukleinskih kiselina.Poslednjih decenija, mnogi prenosivi mikrofluidni uređaji opremljeni PCR termalnim cikličnim sistemima su razvijeni da zadovolje potrebe dijagnostike na licu mesta [57, 58].On-chip PCR se može podijeliti u četiri tipa (konvencionalni, kontinuirani protok, prostorno komutirani i konvektivni PCR) prema različitim metodama kontrole temperature [59].Na primjer, Gee et al.[60] razvili su kvantitativnu PCR metodu direktne reverzne transkripcije (RT-qPCR) na vlastitoj mikrofluidnoj platformi za multipleksnu detekciju SARS-CoV-2, virusa influence A i B u uzorcima brisa grla (slika 3a).Park i dr.[61] je napravio jednostavan čip za analizu patogena integracijom tankoslojnog PCR-a, elektroda i mikrofluidnog modula baziranog na polidimetilsiloksanu koji se upravlja prstima.Međutim, oba rada utjelovljuju zajedničke nedostatke konvencionalnog PCR-a.PCR zahtijeva termalni ciklus, što ograničava dalju minijaturizaciju uređaja i smanjuje vrijeme testiranja.
Razvoj mikrofluidnog PCR-a zasnovanog na kontinuiranom protoku i PCR-a s komutacijom prostora je ključan za rješavanje ovog problema.Koristeći dugi serpentinasti kanal ili kratki pravi kanal, PCR sa kontinuiranim protokom može da obezbedi brzo pojačanje aktivnim cirkulacijom reagensa u tri zone prethodnog zagrevanja sa pumpom van čipa.Ova operacija uspješno izbjegava prijelaznu fazu između različitih temperatura reakcije i na taj način značajno skraćuje vrijeme testiranja [62] (slika 3b).U drugoj studiji Junga i sar.[63] je predložio novi rotacioni PCR genetski analizator koji kombinuje karakteristike fiksnog i protočnog PCR-a za ultrabrzu i multipleksnu reverznu transkripcionu PCR (slika 3c).Za amplifikaciju nukleinske kiseline, PCR mikročip će se rotirati kroz tri grijaća bloka na različitim temperaturama: 1. Denaturacijski blok 94°C, 2. Blok žarenja na 58°C, 3. Blok ekspanzije na 72°C.
Primjena PCR-a u mikrofluidici.Šematski prikaz dirRT-qPCR na mikrofluidnoj platformi (prilagođeno iz [60]).b Šematski prikaz kontinualnog protoka PCR mikroniza zasnovanog na serpentinskom kanalu (prilagođeno iz [62]).c Šematski prikaz rotacionog PCR genetskog analizatora, koji se sastoji od mikročipa, tri grejna bloka i koračnog motora (prilagođeno iz [63]).d Dijagram termokonvekcijske PCR sa centrifugiranjem i podešavanjem (prilagođeno iz [64]).DirRT-qPCR, lančana reakcija polimeraze direktne kvantitativne reverzne transkripcije
Koristeći kapilare i petlje ili čak tanke ploče, konvekcijski PCR može brzo amplificirati nukleinske kiseline prirodnom slobodnom termalnom konvekcijom bez potrebe za vanjskom pumpom.Na primjer, mikrofluidna platforma cikličkog olefinskog polimera razvijena je na fabrikovanoj rotirajućoj fazi grijanja koja koristi termički ciklus sa centrifugiranjem u mikrokanalu PCR petlje [64] (slika 3d).Reakciona otopina se pokreće termičkom konvekcijom, koja kontinuirano izmjenjuje visoku i nisku temperaturu u mikrokanalu s prstenastom strukturom.Cijeli proces amplifikacije može se završiti za 10 minuta sa granicom detekcije od 70,5 pg/kanal.
Kao što se i očekivalo, brzi PCR je moćan alat za potpuno integrisane sisteme za molekularnu dijagnostiku i multipleksnu analizu odgovora na uzorak.Brzi PCR značajno smanjuje vrijeme potrebno za otkrivanje SARS-CoV-2, što doprinosi efikasnoj kontroli pandemije COVID-19.
PCR zahtijeva složen termalni ciklus koji nije prikladan za POCT.U novije vreme, tehnike izotermne amplifikacije su primenjene na mikrofluidiku, uključujući, ali ne ograničavajući se na LAMP, amplifikaciju polimeraze rekombinaze (RPA) i amplifikaciju zasnovanu na sekvencama nukleinskih kiselina [65,66,67,68].Ovim tehnikama, nukleinske kiseline se umnožavaju na konstantnoj temperaturi, olakšavajući stvaranje jeftinih, visoko osjetljivih prijenosnih POCT uređaja za molekularnu dijagnostiku.
Visokopropusni LAMP testovi zasnovani na mikrofluidima omogućavaju višestruko otkrivanje zaraznih bolesti [42, 69, 70, 71].U kombinaciji sa centrifugalnim mikrofluidnim sistemom, LAMP može dodatno olakšati automatizaciju detekcije nukleinskih kiselina [69, 72, 73, 74, 75].Spi-and-react SlipChip razvijen je za vizualnu detekciju više paralelnih bakterija pomoću LAMP-a [76] (slika 4a).Kada se koristi optimizirana LAMP u testu, omjer fluorescentnog signala i šuma bio je približno 5 puta, a granica detekcije je dostigla 7,2 kopije/μl genomske DNK. Osim toga, postojanje pet uobičajenih probavnih bakterijskih patogena, uključujući Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis i Vibrio parahaemolyticus, vizualizirano je na osnovu metode za < 60 min. Osim toga, postojanje pet uobičajenih probavnih bakterijskih patogena, uključujući Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis i Vibrio parahaemolyticus, vizualizirano je na osnovu metode za < 60 min.Osim toga, prisustvo pet uobičajenih bakterijskih patogena probavnog trakta, uključujući Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis i Vibrio parahaemolyticus, vizualizirano je ovom metodom za manje od 60 minuta.此外, 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 可 视化 了 五 种 常见 消化道 细菌病 的 存在, 包括 蜡状 芽孢杆菌, 大 肠杆菌, 肠 沙门 氏 菌, 河流 弧菌 和 副溶血性 弧菌.此外, 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 视化 了 五 种 常见 消化道 细菌病 的 五, 包括 芽孢杆菌, 大 肠杆菌, 肠 氏 菌, 弧菌 和 副溶血 性 ... 弧菌 弧菌 弧菌弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 HIPUz to, prisustvo pet uobičajenih bakterijskih gastrointestinalnih patogena, uključujući Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvius i Vibrio parahaemolyticus, vizualizirano je ovom metodom za manje od 60 minuta.
Prednosti LAMP-a u mikrofluidici uključuju, između ostalog, brzu reakciju i minijaturiziranu detekciju.Međutim, zbog temperature reakcije (oko 70°C), aerosoli se neizbježno stvaraju tokom LAMP-a, što rezultira velikom stopom lažno pozitivnih rezultata.Specifičnost analize, dizajn prajmera i kontrola temperature takođe treba da budu optimizovani za LAMP.Osim toga, dizajni čipova koji implementiraju višestruku detekciju ciljeva na jednom čipu su od velike vrijednosti i treba ih razviti.Osim toga, LAMP je pogodan za višenamjensku detekciju integriranu u jedan čip, što je od velike važnosti, ali još uvijek ima puno prostora za razvoj.
Visoka stopa lažno pozitivnih LAMP-a može se djelomično smanjiti s RPA, jer relativno niska temperatura reakcije (~37 °C) rezultira relativno malo problema isparavanja [77].U RPA sistemu, dva suprotna prajmera pokreću sintezu DNK vezivanjem za rekombinazu i amplifikacija se može završiti u roku od 10 minuta [78,79,80,81].Stoga je cijeli RPA proces mnogo brži od PCR-a ili LAMP-a.Poslednjih godina pokazalo se da mikrofluidna tehnologija dodatno poboljšava brzinu i tačnost RPA [82,83,84].Na primjer, Liu et al.[85] razvio je mikrofluidni integrisani test amplifikacije polimeraze rekombinaze lateralnog toka za brzo i osjetljivo otkrivanje SARS-CoV-2 integracijom RPA reverzne transkripcije (RT-RPA) i univerzalnog sistema za detekciju test traka sa bočnim protokom.u jedan mikrofluidni sistem.Slika 4b).Granica detekcije je 1 kopija/µl ili 30 kopija/uzorak, a detekcija se može završiti za oko 30 minuta.Kong et al.razvili su nosivi mikrofluidni uređaj.[86] koristili su tjelesnu temperaturu i sistem za detekciju fluorescencije zasnovan na mobilnom telefonu da brzo i direktno detektuju HIV-1 DNK koristeći RPA (slika 4c).Nosivi RPA test detektuje 100 kopija/mL ciljne sekvence u roku od 24 minuta, što pokazuje veliki potencijal za brzu dijagnozu novorođenčadi zaražene HIV-1 u okruženjima sa ograničenim resursima.
Izotermno pojačanje u testiranju na licu mjesta (POCT).Razvoj i proizvodnja spin i reakcijskog SlipChip-a.Nakon plazma zavarivanja, gornji i donji čipovi su spojeni sa setom matica kako bi se formirao konačni čip (prilagođeno iz [76]).b Šema MI-IF-RPA sistema za otkrivanje COVID-19 (prilagođeno iz [85]).c Šema nosivog RPA testa za brzo otkrivanje HIV-1 DNK (prilagođeno iz [86]).SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM karboksifluorescein, virus humane imunodeficijencije HIV, RPA rekombinaza polimeraza amplifikacija, LED dioda koja emituje svjetlost, MI-IF Integralse F-RPA Amplification
RPA baziran na mikrofluidima se brzo razvija, međutim, troškovi proizvodnje čipova i potrošnja reakcija su previsoki i moraju se smanjiti kako bi se povećala dostupnost ove tehnologije.Osim toga, visoka osjetljivost RPA može utjecati na amplifikaciju nespecifičnih proizvoda, posebno u prisustvu kontaminacije.Ova ograničenja mogu uticati na primenu RPA u mikrofluidnim sistemima i zaslužuju dalju optimizaciju.Dobro dizajnirani prajmeri i sonde za različite mete su takođe potrebni da bi se poboljšala izvodljivost mikrofluidnih strategija zasnovanih na RPA u POCT.
Cas13 i Cas12a imaju sposobnost da nasumično cijepaju nukleinske kiseline i stoga se mogu razviti kao alati za detekciju i dijagnostiku.Cas13 i Cas12a se aktiviraju nakon vezivanja za ciljnu DNK ili RNK, respektivno.Jednom aktiviran, protein počinje da cijepa druge obližnje nukleinske kiseline, nakon čega vodeće RNK koje ciljaju nukleinske kiseline specifične za patogene mogu cijepati ugašene fluorescentne sonde i osloboditi fluorescenciju.Na osnovu ove teorije, Kellner et al.[87] su razvili metodu zasnovanu na Cas13 [Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKING (SHERLOCK)], a Broughton et al.[88] razvili su još jedan pristup zasnovan na Cas12a [CRISPR Trans Reporter targeting DNK endonuclease (DTECR)].
Poslednjih godina pojavile su se različite metode za detekciju nukleinskih kiselina zasnovane na CRISPR [89, 90].Konvencionalne metode zasnovane na CRISPR-u često zahtijevaju mnogo vremena i truda zbog višestrukih procedura uključujući ekstrakciju nukleinske kiseline, amplifikaciju i CRISPR detekciju.Izlaganje tečnosti vazduhu može povećati mogućnost lažno pozitivnih rezultata.Imajući u vidu gore navedeno, sistemima zasnovanim na CRISPR-u preko je potrebna optimizacija.
Pneumatski kontrolirana mikrofluidna platforma koja može paralelno izvoditi 24 analize razvijena je za aplikacije detekcije CRISPR-Cas12a i CRISPR-Cas13a [91].Sistem je opremljen uređajem za detekciju fluorescencije koji zaobilazi amplifikaciju nukleinske kiseline i automatski detektuje femtomolarne uzorke DNK i RNK.Chen et al.[92] integrisana amplifikacija rekombinaze sa CRISPR-Cas12a sistemom u centrifugalnoj mikrofluidici (slika 5a).Ovaj rad prevazilazi poteškoće integracije ova dva procesa jer Cas12a može probaviti DNK glasnika i inhibirati proces amplifikacije.Osim toga, Chen et al.[92] dodatno su prethodno uskladištili reagense u centrifugalnoj mikrofluidnoj kontroli kako bi automatski dovršili cijeli proces.U drugom radu, Silva et al.[93] razvio je dijagnostičku metodu bez CRISPR/Cas12a amplifikacije i pametni telefon za otkrivanje SARS-CoV-2 (slika 5b).Ovaj test, poznat kao sistem bez pojačanja zasnovan na mobilnom telefonu, uključuje enzim zavisan od CRISPR/Cas koji se zasniva na vizualizaciji pametnog telefona signala mjehurića generiranih katalazom u mikrofluidnim kanalima.Osetljiva detekcija manje od 50 kopija/µl nukleinske kiseline bez prethodnog pojačavanja, ceo proces od ubrizgavanja uzorka do očitavanja signala traje samo 71 minut.
Metode detekcije nukleinskih kiselina zasnovane na CRISPR-u.Centrifugalni POCT za integrisanu molekularnu dijagnostiku zasnovanu na CRISPR-u (preuzeto iz [92]).b Razvoj CASCADE testa za analizu SARS-CoV-2 na pametnom telefonu (prilagođeno iz [93]).RAA rekombinaza amplifikacija, PAM susjedni protospacer motiv, CRISPR skupljena kratka palindromska ponavljanja u pravilnim intervalima, CASCADE sistem bez pojačanja mobilnog telefona sa enzimima zavisnim od CRISPR/CAS, 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]karbodiimid hidrohlorid EDC
Kao posljednji korak u detekciji nukleinske kiseline, detekcija signala direktno odražava dijagnostičke rezultate i kritičan je faktor u razvoju efikasnog, osjetljivog i preciznog POCT-a.Signali se mogu očitati korištenjem različitih metoda kao što su fluorescentne, elektrohemijske, kolorimetrijske i magnetske strategije.U ovom dijelu opisujemo obrazloženje svakog pristupa i upoređujemo molekularnu dijagnostiku zaraznih bolesti u mikrofluidici.
Strategije zasnovane na fluorescenciji se široko koriste za POCT dijagnostiku infektivnih bolesti zbog svojih izuzetnih prednosti odlične osjetljivosti, niske cijene, jednostavnosti rada i analize na mjestu zbrinjavanja [94, 95].Ove strategije koriste označene fluorofore kao što su fluorescentne boje i nanomaterijali za stvaranje signala koji se može detektovati (pojačavanje ili gašenje fluorescencije).Ovaj nalaz sugerira da se strategije zasnovane na fluorescenciji mogu podijeliti na direktno fluorescentno obilježavanje, signalno uključeno i signalno isključeno fluorescentno otkrivanje [96].Direktno otkrivanje fluorescentnih oznaka koristi posebne fluorescentne oznake za označavanje specifičnih liganada koji stvaraju određenu količinu fluorescencije kada se selektivno vežu za cilj.Za detekciju fluorescencije na osnovu signala, kvalitet fluorescentnog signala je pozitivno povezan sa veličinom od interesa.Intenzitet fluorescencije je zanemariv u odsustvu mete i može se otkriti kada je prisutna dovoljna količina mete.Suprotno tome, intenzitet fluorescencije detektovan fluorescencijom „isključenog signala“ obrnuto je proporcionalan količini mete, u početku dostižući maksimalnu vrijednost i postepeno opadajući kako se cilj povećava.Na primjer, koristeći CRISPR-Cas13a mehanizam trans-cijepanja ovisnog o cilju, Tian et al.[97] razvili su novu strategiju prepoznavanja za detekciju RNK koje direktno zaobilaze reverznu transkripciju (slika 6a).Nakon vezivanja za komplementarne ciljne RNK, CRISPR-Cas13-RNA kompleks se može aktivirati, pokrećući transkolateralno cijepanje od strane nespecifičnih reporterskih RNK.Fluorescentno označeni reporter [fluorofor (F)] se gasi pomoću gasitelja (Q) neoštećen i fluorescira kada ga cijepa aktivirani kompleks.
Prednost elektrohemijske detekcije je velika brzina detekcije, laka proizvodnja, niska cena, laka za nošenje i automatska kontrola.To je moćna analitička metoda za POCT aplikacije.Na osnovu grafenskih tranzistora sa efektom polja Gao et al.[98] razvili su nanobiosenzor za multipleksnu detekciju antigena lajmske bolesti iz bakterije Borrelia burgdorferi sa granicom detekcije od 2 pg/mL (slika 6b).
Kolorimetrijski testovi su korišćeni u POCT aplikacijama, koristeći prednosti prenosivosti, niske cene, lakoće pripreme i vizuelnog očitavanja.Kolorimetrijska detekcija može koristiti oksidaciju peroksidaze ili nanomaterijala sličnih peroksidazi, agregaciju nanomaterijala i dodavanje indikatorskih boja za pretvaranje informacija o prisutnosti ciljnih nukleinskih kiselina u vidljive promjene boje [99, 100, 101].Značajno je da se nanočestice zlata široko koriste u razvoju kolorimetrijskih strategija, a zbog njihove sposobnosti da izazovu brze i značajne promjene boje, sve je veći interes za razvoj POCT kolorimetrijskih platformi za in situ dijagnozu zaraznih bolesti [102].Sa integriranim centrifugalnim mikrofluidnim uređajem [103], patogeni koji se prenose hranom u uzorcima kontaminiranog mlijeka mogu se automatski detektovati na nivou od 10 bakterijskih ćelija, a rezultati se mogu vizualno očitati u roku od 65 minuta (slika 6c).
Tehnike magnetnog sensinga mogu precizno otkriti analite pomoću magnetnih materijala, a posljednjih decenija postoji značajan interes za POCT aplikacije.Tehnike magnetnog sensinga imaju neke jedinstvene prednosti kao što su jeftini magnetni materijali umjesto skupih optičkih komponenti.Međutim, upotreba magnetnog polja poboljšava efikasnost detekcije i skraćuje vrijeme pripreme uzorka [104].Osim toga, rezultati magnetnog sondiranja pokazuju visoku specifičnost, osjetljivost i visok omjer signal-šum zbog neznatnog magnetskog pozadinskog signala bioloških uzoraka [105].Sharma et al.integrisao biosenzor baziran na magnetnom tunelskom spoju u prenosivu platformu za mikročip.[106] za multipleksnu detekciju patogena (slika 6d).Biosenzori osjetljivo otkrivaju subnanomolarne nukleinske kiseline izolirane iz patogena.
Tipična metoda detekcije signala.Koncept hiperlokalizirane detekcije Cas13a (prilagođeno iz [97]).b Grafenski nanobiosenzor FET u kombinaciji sa Lyme GroES scFv (prilagođeno iz [98]).c Kolorimetrijske indikacije za multipleksnu detekciju patogena iz hrane u centrifugalnom mikrofluidnom čipu: uzorci br. 1 i br. 3 sa ciljnim patogenima i uzorci br. 2, br. 4 i br. 5 bez ciljnih patogena (prilagođeno iz [103]) .d Biosenzor zasnovan na magnetnom tunelskom spoju, uključujući platformu, ugrađeno pojačalo za blokiranje, kontrolnu jedinicu i napajanje za generisanje/akviziciju signala (prilagođeno iz [106]).GFET Graphene FET, Escherichia coli, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS Dimetikon, PMMA polimetil metakrilat
Unatoč odličnim karakteristikama gore navedenih metoda detekcije, one i dalje imaju nedostatke.Ove metode su upoređene (tabela 1), uključujući neke aplikacije sa detaljima (za i protiv).
Sa razvojem mikrofluidike, mikroelektromehaničkih sistema, nanotehnologije i nauke o materijalima, upotreba mikrofluidnih čipova za otkrivanje zaraznih bolesti stalno napreduje [55,96,107,108].Precizna manipulacija minijaturnom opremom i tekućinama doprinosi dijagnostičkoj točnosti i isplativosti.Stoga su za daljnji razvoj uloženi napori na optimizaciju i nadogradnju čipova, što je rezultiralo različitim mikrofluidnim čipovima s različitim strukturama i funkcijama.Ovdje ukratko predstavljamo nekoliko uobičajenih tipova mikrofluidnih platformi i upoređujemo njihove karakteristike (za i protiv).Osim toga, većina dolje navedenih primjera prvenstveno se fokusira na borbu protiv SARS-CoV-2.
LOCC su najčešći minijaturizirani složeni analitički sistemi i njihove operacije su visoko minijaturizirane, integrirane, automatizirane i paralelizirane od ubrizgavanja i pripreme uzorka, kontrole protoka i detekcije tekućine [109, 110].Tečnostima se manipuliše kroz pažljivo dizajniranu geometriju i interakciju mnogih fizičkih efekata kao što su gradijenti pritiska, kapilarno delovanje, elektrodinamika, magnetna polja i akustični talasi [111].LOCC pokazuje odlične prednosti u visokopropusnom skriningu i višestrukoj detekciji, sa velikom brzinom analize, malom veličinom uzorka, malom potrošnjom energije i visokom efikasnošću upravljanja i rada;međutim, LOCC uređaji su veoma delikatni, i proizvodnja, pakovanje i povezivanje.Međutim, multipleksiranje i ponovna upotreba suočavaju se s ogromnim poteškoćama [96].U poređenju sa drugim platformama, LOCC ima jedinstvene prednosti u smislu maksimalne raznovrsnosti aplikacija i najbolje kompatibilnosti tehnologije, ali su očigledni i njegovi nedostaci, odnosno visoka složenost i loša ponovljivost.Ovisnost o vanjskim pumpama, koje su često glomazne i skupe, dodatno ograničava njihovu upotrebu u POCT-u.
Tokom izbijanja COVID-19, LOCC je dobio veliku pažnju.Istovremeno, postoji nekoliko novih čipova koji kombinuju nekoliko tehnologija.Na primjer, pametni telefoni se sada naširoko koriste kao prenosivi uređaji za analizu i imaju veliki potencijal za LOCC integraciju.Sun et al.[21] proizveo je mikrofluidni čip koji omogućava multipleksiranje specifičnih sekvenci nukleinskih kiselina pet patogena, uključujući SARS-CoV-2, koristeći LAMP i analizirao ih pomoću pametnog telefona u roku od 1 sata nakon završetka reakcije.Kao drugi primjer, Sundah et al.[112] kreirao je molekularni prekidač [katalitičko pojačanje pomoću prekidača molekularnog prelaznog stanja (CATCH)] za direktnu i osjetljivu detekciju SARS-CoV-2 RNK ciljeva pomoću pametnih telefona. CATCH je kompatibilan sa prenosivim LOCC-om i postiže superiorne performanse (približno 8 kopija RNK/μl; < 1 h na sobnoj temperaturi) [112]. CATCH je kompatibilan sa prenosivim LOCC-om i postiže superiorne performanse (približno 8 kopija RNK/μl; < 1 h na sobnoj temperaturi) [112]. CATCH je kompatibilan sa portativnim LOCC-om i obezbeđuje vrhunsku proizvodnju (primerno 8 kopija RNK/mkl; < 1 h pri sobnoj temperaturi) [112]. CATCH je kompatibilan sa prenosivim LOCC-om i pruža odličnu propusnost (približno 8 kopija RNK/µl; < 1 h na sobnoj temperaturi) [112]. CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小贝/μl；室温下< 1 小112）む CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小贝/μl；室温下< 1 小112）む CATCH je kompatibilan sa portativnim LOCC-om i ima vrhunsku produktivnost (primerno 8 kopija RNK/mkl; < 1 sat pri sobnoj temperaturi) [112]. CATCH je kompatibilan sa prenosivim LOCC-ima i ima odlične performanse (približno 8 kopija RNK/µl; < 1 sat na sobnoj temperaturi) [112].Osim toga, LOCC uređaji za molekularnu dijagnostiku također koriste neke pokretačke sile kao što su vakuum, rastezanje i električna polja.Kang et al.[113] demonstrirali su ultra brzi nanoplazma na čipu PCR u realnom vremenu za brzu i kvantitativnu dijagnozu COVID-19 na terenu koristeći vakuumski plazmonski tekući PCR čip.Li et al.[114] je potom razvio mikrofluidni čip koji je pokretan rastezanjem i koji je omogućio dijagnozu COVID-19.Platforma koristi RT-LAMP sistem pojačanja kako bi utvrdila da li je uzorak kvalitativno pozitivan ili negativan.Nakon toga, Ramachandran et al.[115] su postigli odgovarajuće gradijente električnog polja koristeći izotahoforezu (ITP), tehniku selektivnog fokusiranja jona implementirane u mikrofluidici.Uz ITP, ciljna RNK iz sirovih uzoraka nazofaringealnog brisa može se automatski pročistiti.Zatim Ramachandran i dr.[115] Kombinacijom ovog pročišćavanja ITP-a sa LAMP-om poboljšanim ITP i CRISPR testovima otkriven je SARS-CoV-2 u humanom nazofaringealnom brisu i kliničkim uzorcima za oko 35 minuta.Osim toga, stalno se pojavljuju nove ideje.Jadhav et al.[116] je predložio dijagnostičku shemu zasnovanu na površinski poboljšanoj Raman spektroskopiji u kombinaciji s mikrofluidnim uređajem koji sadrži ili vertikalno orijentirane ugljične nanocijevi obložene zlatom/srebrom ili jednokratne elektrospredene mikro/nanocijevi.Ugrađeni filter mikrokanali funkcionalizirani membranom su jednokratni.Uređaj adsorbuje viruse iz raznih telesnih tečnosti/izlučivanja kao što su pljuvačka, nazofarinks i suze.Dakle, titar virusa je obilan i virus se može precizno identificirati Ramanovim potpisom.
LOAD je centrifugalna mikrofluidna platforma u kojoj se svi procesi kontroliraju frekvencijskim protokolom koji rotira mikrostrukturirani supstrat [110].Uređaj LOAD karakterizira korištenje centrifugalne sile kao važne pokretačke sile.Tečnosti su takođe podložne kapilarnim, Eulerovim i Koriolisovim silama.Koristeći uređaj za centrifugu, analize se izvode u kontinuiranom tečnom radu od radijalnog prema unutra prema van, eliminišući potrebu za dodatnim vanjskim cijevima, pumpama, aktuatorima i aktivnim ventilima.Ukratko, jedna metoda kontrole pojednostavljuje rad.Sile koje djeluju na tekućinu u istom mikrofluidnom kanalu na istoj udaljenosti od centra opterećenja su jednake, što omogućava ponavljanje strukture kanala.Dakle, LOAD oprema je jednostavnija i ekonomičnija za projektovanje i proizvodnju od konvencionalne LOCC opreme, dok su reakcije uglavnom nezavisne i paralelne;međutim, zbog visoke mehaničke čvrstoće centrifugalne opreme, dostupni materijal za čips je ograničen i male količine su teške.do auta.Istovremeno, većina LOAD uređaja je dizajnirana samo za jednokratnu upotrebu, što je skupo za detekciju velikih razmjera [96, 117, 118, 119].
Poslednjih decenija, LOAD, koji se smatra jednim od najperspektivnijih mikrofluidnih uređaja, dobio je značajnu pažnju istraživača i proizvođača.Tako je LOAD stekao široku prihvaćenost i koristio se za molekularnu dijagnostiku infektivnih patogena [120, 121, 122, 123, 124], posebno tokom izbijanja COVID-19.Na primjer, krajem 2020. Ji i dr.[60] demonstrirali su direktni RT-qPCR test za brzo i automatizirano paralelno otkrivanje SARS-CoV-2 i infekcija gripom A i B u uzorcima brisa grla.Zatim Xiong et al.[74] predstavili su LAMP integriranu diskoidnu mikrofluidnu platformu za brzo, precizno i istovremeno otkrivanje sedam ljudskih respiratornih koronavirusa, uključujući SARS-CoV-2, u roku od 40 minuta.Početkom 2021. de Oliveira et al.[73] su demonstrirali centrifugalni mikrofluidni čip od polistirenskog tonera, koji se ručno upravlja s rotatorom vrha prsta, za RT-LAMP molekularnu dijagnozu COVID-19.Nakon toga, Dignan et al.[39] predstavili su automatizirani prijenosni mikrouređaj za centrifugu za pročišćavanje SARS-CoV-2 RNK direktno iz bukalnih briseva.Medved i dr.[53] predložio je ugrađeni sistem za uzorkovanje aerosola SARS-CoV-2 s malim rotirajućim mikrofluidnim fluorescentnim čipom s granicom detekcije od 10 kopija/μL i minimalnim pragom ciklusa od 15 minuta.Suarez et al.[75] je nedavno izvijestio o razvoju integrirane modularne centrifugalne mikrofluidne platforme za direktnu detekciju SARS-CoV-2 RNK u uzorcima nazofaringealnog brisa inaktiviranih toplinom koristeći LAMP.Ovi primjeri pokazuju velike prednosti i obećanja LOAD-a u molekularnoj dijagnostici COVID-19.
Godine 1945. Muller i Clegg [125] prvi su predstavili mikrofluidne kanale na papiru koristeći filter papir i parafin.Godine 2007. grupa Whitesides [126] stvorila je prvu funkcionalnu papirnu platformu za testiranje proteina i glukoze.Papir je postao idealan supstrat za mikrofluidiku.Papir ima inherentna svojstva kao što su hidrofilnost i porozna struktura, odlična biokompatibilnost, mala težina, fleksibilnost, savitljivost, niska cijena, jednostavnost upotrebe i praktičnost.Klasični µPAD se sastoje od hidrofilnih/hidrofobnih struktura izgrađenih na papirnim podlogama.Ovisno o trodimenzionalnoj strukturi, μPAD-ovi se mogu podijeliti na dvodimenzionalne (2D) i trodimenzionalne (3D) μPAD-ove.2D µPAD-ovi se proizvode formiranjem hidrofobnih granica za formiranje mikrofluidnih kanala, dok se 3D µPAD-ovi obično prave od hrpa slojeva 2D mikrofluidnog papira, ponekad savijanjem papira, tehnikama klizanja, otvorenim kanalima i 3D štampanjem [96].Vodene ili biološke tekućine na μPAD primarno se kontroliraju kapilarnom silom bez vanjskog izvora napajanja, olakšavajući prethodno skladištenje reagensa, rukovanje uzorcima i multipleks detekciju.Međutim, precizna kontrola protoka i detekcija multipleksa su otežani nedovoljnom brzinom detekcije, osjetljivošću i ponovnom upotrebom [96, 127, 128, 129, 130].
Kao neobična mikrofluidna platforma, μPAD je naširoko promoviran i razvijen za molekularnu dijagnozu zaraznih bolesti kao što su HCV, HIV i SARS-CoV-2 [131, 132].Za selektivnu i osjetljivu detekciju HCV-a, Tengam et al.[133] razvio je novi biosenzor baziran na fluorescentnom papiru koristeći visoko specifičnu sondu nukleinske kiseline na bazi pirolidinil peptida.Nukleinske kiseline se kovalentno imobiliziraju na djelomično oksidiranom celuloznom papiru reduktivnom alkilacijom između amino grupa i aldehidnih grupa, a detekcija se temelji na fluorescenciji.Ove signale može očitati posebno napravljen uređaj sa prijenosnom fluorescentnom kamerom u kombinaciji s kamerom mobilnog telefona.Nakon toga, Lu et al.[134] dizajnirao je fleksibilnu elektrodu baziranu na papiru zasnovanu na nanočesticama nikla/zlata/ugljeničnim nanocevima/polivinil alkoholu organometalnog okvira za detekciju HIV cilja DNK hibridizacijom koristeći metilen plavo kao DNK redoks indikator.Nedavno su Chowdury et al.[135] predstavili su hipotetički dizajn platforme za µPAD testiranje na mjestu pružanja njege koristeći sirovu pljuvačku pacijenta u kombinaciji s LAMP-om i prijenosnom tehnologijom snimanja za otkrivanje analita COVID-19.
Testovi bočnog protoka vode fluide pomoću kapilarnih sila i kontrolišu kretanje fluida na osnovu vlaženja i karakteristika poroznih ili mikrostrukturiranih podloga.Uređaji za bočni protok sastoje se od uzorka, konjugata, inkubatora i detektora i upijajućih jastučića.Molekuli nukleinske kiseline u LFA prepoznaju specifična veziva koja su prethodno uskladištena na mjestu vezivanja i vezuju se kao kompleksi.Kako tečnost prolazi kroz ploče za inkubaciju i detekciju, kompleksi se hvataju od strane molekula za hvatanje koji se nalaze na test i kontrolnim linijama, pokazujući rezultate koji se mogu očitati direktno golim okom.Obično se LFA može završiti za 2-15 minuta, što je brže od tradicionalnog otkrivanja.Zbog posebnog mehanizma, LFA zahtijeva malo operacija i ne zahtijeva dodatnu opremu, što ga čini vrlo jednostavnim za korištenje.Lako se proizvodi i minijaturizira, a cijena papirnih podloga je niža.Međutim, koristi se samo za kvalitativnu analizu, a kvantitativna detekcija je veoma teška, a sposobnost multipleksiranja i propusnost su veoma ograničeni, a istovremeno se može detektovati samo jedna dovoljna nukleinska kiselina [96,110,127].
Iako je većina primjena LFA fokusirana na imunotestove, upotreba LFA za molekularnu dijagnostiku u mikrofluidnim čipovima je također efikasna i popularna [136].U slučaju virusa hepatitisa B, HIV-a i SARS-CoV-2 LFA Gong et al.[137] predložio je LFA platformu za nanočestice sa povećanom konverzijom i pokazao svestranost ove minijaturizirane i prenosive platforme kroz osjetljivu i kvantitativnu detekciju višestrukih meta kao što je HBV nukleinska kiselina.Osim toga, Fu et al.[138] su demonstrirali novi LFA zasnovan na površinski poboljšanoj Raman spektroskopiji za kvantitativnu analizu HIV-1 DNK pri niskim koncentracijama.Za brzo i osjetljivo otkrivanje SARS-CoV-2, Liu et al.[85] razvio je mikrofluidnu integrisanu RPA analizu bočnog protoka kombinovanjem RT-RPA i univerzalnog sistema za detekciju bočnog protoka u jedan mikrofluidni sistem.
Primjena različitih mikrofluidnih platformi varira ovisno o specifičnim studijama, koristeći punu prednost mogućnosti i prednosti platformi.Sa pristupačnim ventilima, pumpama i kanalima, LOCC je najsveobuhvatnija platforma za raznovrsnost aplikacija i interoperabilnost sa najvećim prostorom za razvoj.Stoga se nadamo i preporučujemo da se najnovija istraživanja izvedu u LOCC-u kao prvi pokušaj i da se uslovi optimiziraju.Osim toga, očekuje se da se u sistemu otkriju i koriste efikasnije i preciznije metode.LOAD se ističe u preciznoj kontroli fluida iz postojećih LOCC uređaja i pokazuje jedinstvene prednosti u pojedinačnim pogonima pomoću centrifugalne sile bez potrebe za eksternim pogonima, dok paralelni odgovori mogu biti odvojeni i sinhronizovani.Tako će u budućnosti LOAD postati glavna mikrofluidna platforma sa manje ručnih operacija i zrelijim i automatizovanim tehnologijama.µPAD platforma kombinuje prednosti LOCC-a i materijala na papiru za jeftinu dijagnostiku za jednokratnu upotrebu.Stoga bi se budući razvoj trebao fokusirati na pogodne i dobro uspostavljene tehnologije.Osim toga, LFA je vrlo prikladan za detekciju golim okom, obećavajući smanjenje potrošnje uzorka i ubrzanje detekcije.Detaljno poređenje platforme prikazano je u tabeli 2.
Digitalne analize dijele uzorak na mnogo mikroreaktora, od kojih svaki sadrži diskretni broj ciljnih molekula [139, 140].Digitalni testovi nude značajne prednosti za izvođenje apsolutne kvantifikacije izvođenjem hiljada paralelnih biohemijskih eksperimenata istovremeno i pojedinačno u odjeljcima mikronske skale umjesto u kontinuiranoj fazi.U poređenju sa tradicionalnom mikrofluidikom, kompartment reakcije mogu smanjiti zapreminu uzorka, povećati efikasnost reakcije i lako se integrisati sa drugim analitičkim metodama bez potrebe za kanalima, pumpama, ventilima i kompaktnim dizajnom [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147] .Sljedeće dvije metode se koriste u digitalnim testovima za postizanje ujednačenog i preciznog odvajanja rastvora, uključujući reagense i uzorke kao što su ćelije, nukleinske kiseline i druge čestice ili molekule: (1) emulzije kapljica koje iskorištavaju nestabilnost sučelja tekućine;(2) podjela niza se vrši geometrijskim ograničenjima uređaja.U prvoj metodi, kapljice koje sadrže reagense i uzorke u mikrokanalima mogu se stvoriti pasivnim metodama kao što su istovremena struja, unakrsni tok, fokusiranje protoka, stepenasto emulgiranje, mikrokanalna emulzifikacija i membrane kroz viskozne smične sile i emulgiranje sa promjenom kanala.lokalizacijom [143, 145, 146, 148, 149] ili korištenjem aktivnih metoda [150, 151], koje unose dodatnu energiju kroz električnu, magnetsku, termičku i mehaničku kontrolu.U posljednjem pristupu, najbolja uniformnost volumena tekućine u mikrofluidnim komorama dijeli se zadržavanjem prostornih struktura iste veličine, kao što su mikrojame i površinski nizovi [152,153,154].Primjetno, kapljice su glavni dijelovi protoka koji se također mogu generirati i manipulirati na nizovima elektroda zasnovanim na digitalnoj mikrofluidici (DMF).Elektrokvašenje dielektrika jedna je od najbolje proučavanih teorija DMF-a, budući da elektrokvašenje dielektrika omogućava preciznu manipulaciju pojedinačnih kapi, kontrolirajući oblik tekućine i asimetrične električne signale koji prolaze kroz različite strane [141, 144].Glavne operacije s kapljicama u DMF-u uključuju sortiranje, cijepanje i spajanje [151, 155, 156], koje se mogu primijeniti u različitim poljima analize, posebno u molekularnoj detekciji [157, 158, 159].
Digitalna detekcija nukleinskih kiselina je treća generacija molekularne dijagnostičke tehnologije koja prati konvencionalni PCR i kvantitativni PCR u realnom vremenu (qPCR), paralelno sa sekvenciranjem visoke propusnosti i tečnom biopsijom.U posljednje dvije decenije digitalne nukleinske kiseline brzo su se razvile u području molekularne dijagnostike infektivnih patogena [160, 161, 162].Apsolutna kvantifikacija digitalne detekcije nukleinske kiseline počinje pakovanjem uzoraka i reagensa u pojedinačne odjeljke kako bi se osiguralo da svaka ciljna sekvenca ima istu vjerovatnoću ulaska u svaki pojedinačni odjeljak.Teoretski, svakoj sekciji može biti dodijeljeno više ciljnih sekvenci, ili možda ne postoji nezavisni mikroreakcioni sistem.Kroz različite gore opisane mehanizme sensinga, odjeljci s mikrobnim ciljnim sekvencama koji generiraju signale iznad određenog praga mogu se vizualizirati golim okom ili pomoću mašine i označeni su kao pozitivni, dok su ostali dijelovi koji generiraju signale ispod praga označeni kao pozitivni. .negativne, što signal za svaku sekciju čini booleovim.Dakle, izračunavanjem broja stvorenih odjeljaka i stope pozitivnih rezultata nakon reakcije, originalne kopije testnih uzoraka mogu se upariti korištenjem formule Poissonove distribucije bez potrebe za standardnom krivom, koja je potrebna za rutinske kvantitativne analize kao što je kao qPCR.[163] U poređenju sa tradicionalnim molekularnim dijagnostičkim metodama, digitalna detekcija nukleinskih kiselina ima veći stepen automatizacije, veću brzinu i osetljivost analize, manje reagensa, manje kontaminacije i jednostavniji dizajn i proizvodnju.Iz ovih razloga, upotreba digitalnih testova, posebno metoda zasnovanih na kapljicama, za molekularnu dijagnostiku, kombinujući tehnike pojačanja i očitavanja signala, dobro je proučavana tokom kritične epidemije SARS-CoV-2.Na primjer, Yin et al.[164] kombinirale su digitalne kapljice i brze PCR metode za detekciju gena ORF1ab, N i RNase P u SARS-CoV-2 u mikrofluidnom čipu.Značajno je da je sistem bio u stanju da identifikuje pozitivan signal u roku od 115 sekundi, što je brže od konvencionalnog PCR-a, što ukazuje na njegovu efikasnost u detekciji na licu mesta (slika 7a).Dong et al.[165], Sow et al.[157], Chen et al.[166] i Alteri et al.[167] je također primijenio digitalni PCR (ddPCR) za otkrivanje SARS-CoV-2 u mikrofluidnom sistemu sa impresivnim rezultatima.Da bi dalje poboljšali stopu detekcije, Shen et al.[168] je postigao ddPCR baziranu sliku čipa za samo 15 s bez upotrebe tehnika spajanja slika, ubrzavajući proces ddPCR tehnologije od laboratorije do aplikacije.Ne primjenjuju se samo metode termičke amplifikacije kao što je PCR, već se koriste i metode izotermne amplifikacije za pojednostavljenje uvjeta reakcije i brzog odgovora.Lu et al.[71] je razvio SlipChip za analizu kapljica, sposoban da generiše kapljice različitih veličina pri visokim gustinama u jednom koraku i kvantifikuje SARS-CoV-2 nukleinske kiseline koristeći digitalnu LAMP (Slika 7b).Kao tehnologija koja se brzo razvija, CRISPR također može igrati važnu ulogu u digitalnoj detekciji nukleinskih kiselina putem praktičnog kolorimetrijskog snimanja bez potrebe za dodatnim bojama nukleinske kiseline.Ackerman et al.razvio kombinatornu matričnu reakciju za multipleksnu evaluaciju nukleinskih kiselina.[158] otkrili su 169 virusa povezanih s ljudima, uključujući SARS-CoV-2, u kapljicama koje sadrže reagense za detekciju nukleinskih kiselina na bazi CRISPR-Cas13 u mikrojažičkom testu (slika 7c).Osim toga, izotermno pojačanje i CRISPR tehnologija mogu se koristiti u istom sistemu kako bi se objedinile prednosti oba.Park i dr.[169] CRISPR/Cas12a digitalni test je razvijen u komercijalnom mikrofluidnom čipu za detekciju ekstrahovanog i termički ubijenog SARS-CoV-2 na osnovu jednostepenog RT-RPA sa kraćom i većom detekcijom signal-pozadina vremenski odnos., širi dinamički opseg i bolja osjetljivost (slika 7d).Neki opisi ovih primjera dati su u Tabeli 3.
Tipična digitalna platforma za detekciju nukleinskih kiselina.a Brzi digitalni PCR radni tok se sastoji od četiri ključna koraka: priprema uzorka, distribucija reakcione smjese, proces amplifikacije i ciljne kvantifikacije (prilagođeno iz [164]).b Šematski prikaz analize SlipChip kapljica za formiranje kapljica pri velikoj gustoći (prilagođeno iz [71]).c CARMEN-Cas dijagram toka rada13 (prilagođeno iz [158]).d Pregled napredne digitalne detekcije virusa sa CRISPR/Cas u jednom loncu (prilagođeno iz [169]).Bez vode u ulju, polidimetilsiloksan PDMS, PCR polimerazna lančana reakcija, prikupljanje DAQ podataka, PID proporcionalni integralni derivat, CARMEN kombinatorna matrična reakcija za multipleksnu evaluaciju nukleinske kiseline, SARS-CoV-2, teški akutni respiratorni sindrom, koronavirus 2, RT Amplifikacija reverzne transkriptaze rekombinaze polimeraze-RPA, S/B signala u pozadini
Vrijeme objave: Sep-15-2022
