Vijesti

Hvala vam što ste posjetili Nature.com.Verzija pretraživača koju koristite ima ograničenu podršku za CSS.Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažurirani pretraživač (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru).U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Metode enzimskog obilježavanja blizine zasnovane na aktiviranim esterima ili fenoksi radikalima široko se koriste za mapiranje subcelularnih proteoma i proteinskih interaktora u živim stanicama.Međutim, aktivirani estri su manje reaktivni, što rezultira širokim radijusom označavanja, a fenoksi radikali nastali tretmanom peroksidom mogu ometati redoks puteve.Ovdje izvještavamo o metodi fotoaktivacije zavisne od blizine (PDPL) razvijenoj genetskim povezivanjem miniSOG fotosenzibilizatorskog proteina sa proteinom od interesa.Pokrenut plavim svjetlom i kontroliran vremenom izlaganja, stvara se singletni kisik, a zatim se postiže prostorno-vremenski razriješeno obilježavanje histidinskih ostataka pomoću anilinske sonde.Mi demonstriramo njegovu visoku vjernost kroz mapiranje proteoma specifičnog za organele.Usporedno poređenje PDPL-a sa TurboID-om pokazuje specifičniju i sveobuhvatniju proteomsku pokrivenost PDPL-a.Zatim smo primijenili PDPL na transkripcijski koaktivator BRD4 i E3 Parkin ligazu povezanu s bolešću i pronašli prethodno nepoznate interaktore.Skriningom prekomjerne ekspresije, dva nepoznata supstrata, Ssu72 i SNW1, identificirana su za Parkin, čija je degradacija posredovana putem ubikvitinacije-proteazoma.
Precizna karakterizacija proteinskih mreža leži u osnovi mnogih fundamentalnih ćelijskih procesa.Stoga će visoko precizno prostorno-temporalno mapiranje proteinskih interakcija pružiti molekularnu osnovu za dešifriranje bioloških puteva, patologije bolesti i narušavanje ovih interakcija u terapeutske svrhe.U tu svrhu veoma su poželjne metode koje mogu otkriti vremenske interakcije u živim ćelijama ili tkivima.Masena spektrometrija prečišćavanja afiniteta (AP-MS) se istorijski koristila za identifikaciju partnera za vezivanje proteina od interesa (POI).Razvojem kvantitativnih proteomskih metoda stvoren je Bioplex3.0, najveća baza podataka proteinskih mreža zasnovana na AP-MS.Iako je AP-MS vrlo moćan, koraci ćelijske lize i razrjeđivanja u toku rada su pristrasni prema slabim i prolaznim interakcijama vezivanja i uvode artefakte nakon lize kao što su lažni interakcijski parovi kojima nedostaje razdvajanje prije lize.
Za rješavanje ovih problema razvijene su neprirodne aminokiseline (UAA) s umreženim grupama i platforme za enzimsko obilježavanje u blizini (PL) (npr. APEX i BioID)5.Iako je UAA metoda uspješno primijenjena u mnogim scenarijima i pruža informacije o direktnim proteinskim adhezivima, optimizacija mjesta umetanja UAA i dalje je potrebna.Što je još važnije, to je stehiometrijska metoda označavanja kojoj nedostaje katalitički preokret događaja obilježavanja.Nasuprot tome, enzimske PL metode, kao što je BioID metoda, spajaju konstruiranu biotinsku ligazu u POI7, koji potom aktivira biotin da bi se formirao reaktivni biotinil-AMP ester intermedijer.Enzim tako katalizira i oslobađa aktivirani biotinski "oblak" koji označava proksimalne ostatke lizina.Međutim, BioID-u je potrebno više od 12 sati da dobije dovoljan označeni signal, što onemogućuje njegovu upotrebu uz vremensku rezoluciju.Koristeći usmjerenu evoluciju zasnovanu na prikazu kvasca, TurboID je dizajniran na bazi BioID-a kako bi bio efikasniji, omogućavajući efikasno obilježavanje biotinom u roku od 10 minuta, omogućavajući proučavanje dinamičnijih procesa.Budući da je TurboID visoko aktivan i nivoi endogenog biotina su dovoljni za označavanje niskog nivoa, pozadinsko označavanje postaje potencijalni problem kada je potrebno visoko pojačano i vremenski ograničeno označavanje dodatkom egzogenog biotina.Osim toga, aktivirani estri su slabo reaktivni (t1/2 ~5 min), što može dovesti do velikog radijusa obilježavanja, posebno nakon zasićenja susjednih proteina biotinom 5. U drugom pristupu, genetska fuzija konstruirane askorbat peroksidaze (tj. biotin- fenol radikale i omogućava označavanje proteina u roku od jedne minute 9, 10. APEX se široko koristi za identifikaciju subcelularnih proteoma, membranskih proteinskih kompleksa i citosolnih signalnih proteinskih kompleksa 11, 12. Međutim, potreba za visokim koncentracijama peroksida može utjecati na redoks proteine ​​ili puteve, ometajući ćelijskih procesa.
Stoga će nova metoda koja može generirati reaktivnije vrste supresije označenog radijusa s visokom prostornom i vremenskom preciznošću bez značajnog ometanja ćelijskih puteva biti važan dodatak postojećim metodama. Među reaktivnim vrstama, singletni kiseonik je izazvao našu pažnju zbog svog kratkog životnog veka i ograničenog radijusa difuzije (t1/2 < 0,6 µs u ćelijama)13. Među reaktivnim vrstama, singletni kiseonik je izazvao našu pažnju zbog svog kratkog životnog veka i ograničenog radijusa difuzije (t1/2 < 0,6 µs u ćelijama)13. Srednji aktivni oblici naše pažnje privlače pojedinačni kisik iz njegovog kratkog vremena života i ograničenog radiusa difuzije (t1/2 < 0,6 mks u kleti)13. Među aktivnim oblicima, singletni kiseonik je privukao našu pažnju zbog svog kratkog životnog veka i ograničenog radijusa difuzije (t1/2 < 0,6 µs u ćelijama)13.在活性物质中,单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0,6 µs（3 µs） 1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13 Srednji aktivni oblici naše pažnje privlače pojedinačni kisik iz njegovog kratkog vremena života i ograničenog radiusa difuzije (t1/2 < 0,6 mks u kletki). Među aktivnim oblicima, singletni kiseonik privlači našu pažnju zbog svog kratkog životnog veka i ograničenog radijusa difuzije (t1/2 < 0,6 μs u ćelijama).Prijavljeno je da pojedinačni kisik nasumično oksidira metionin, tirozin, histidin i triptofan, čineći ga polarnim 14,15 za vezivanje na sonde na bazi amina ili tiola16,17.Iako se singletni kisik koristi za označavanje RNK subćelijskog odjeljka, strategije za prenamjenu endogenih markera blizine POI ostaju neistražene.Ovdje predstavljamo platformu nazvanu fotoaktivacijsko-zavisno označavanje blizine (PDPL), gdje koristimo plavo svjetlo za osvjetljavanje POI spojenih s fotosenzibilizatorom miniSOG i pokrećemo stvaranje singletnog kisika za oksidaciju proksimalnih ostataka, nakon čega slijede modifikacije koje sadrže amin za oksidaciju hemijskih sondi u srednje žive ćelije..Testirali smo grupu hemijskih sondi kako bismo maksimizirali specifičnost oznake i identifikovali mesta modifikacije koristeći otvoreni proces proteomike.Usporedno poređenje PDPL-a sa TurboID-om pokazuje specifičniju i sveobuhvatniju proteomsku pokrivenost PDPL-a.Primijenili smo ovaj pristup na organele specifične markere subcelularnog proteoma i opću identifikaciju proteoma vezanih partnera za epigenetski regulatorni protein BRD4 povezan s rakom i E3 ligazu Parkin povezan s Parkinsonovom bolešću, što je potvrdilo i poznatu i nepoznatu mrežu proteina. interakcije..Sposobnost PDPL-a da prepozna E3 supstrate u velikim proteinskim kompleksima predstavlja situaciju u kojoj je potrebno prepoznavanje indirektnih veziva.Dva nepoznata supstrata parkina posredovana ubikvitinacionim proteasomom su potvrđena in situ.
Fotodinamička terapija (PDT)19 i laserska inaktivacija potpomognuta hromoforom (CALI)20, u kojoj svjetlosno zračenje fotosenzibilizatorima stvara singletni kisik, može inaktivirati ciljne proteine ​​ili uzrokovati smrt stanice.Budući da je singletni kisik visoko reaktivna supstanca s teoretskom difuzijskom udaljenosti od oko 70 nm, prostorno ograničena oksidacija oko fotosenzibilizatora može se kontrolirati.Na osnovu ovog koncepta, odlučili smo da koristimo singletni kiseonik za postizanje bliskog obeležavanja proteinskih kompleksa u živim ćelijama.Razvili smo PDPL hemoproteomski pristup da ispunimo četiri funkcije: (1) da kataliziramo stvaranje aktivnog singletnog kiseonika slično PL enzimskom pristupu;(2) obezbediti vremenski rešeno obeležavanje nakon pokretanja svetlosti;(3) izmjenom (4) Izbjegavajte korištenje endogenih kofaktora (kao što je biotin) da biste smanjili pozadinu, ili koristite vrlo uznemirujuće egzogene reagense (kao što su peroksidi) kako biste minimizirali izloženost stanica stresu okoline.
Fotosenzibilizatori se mogu podijeliti u dvije kategorije uključujući fluorofore male molekularne težine (npr. bengalska ruža, metilen plavo)22 i genetski kodirane male proteine ​​(npr. miniSOG, KillerRed)23.Da bismo postigli modularni dizajn, razvili smo prvu generaciju PDPL platforme dodavanjem fotosenzibilizatorskih (PS) proteina u POI24,25 (slika 1a).Kada je ozračen plavim svjetlom, singletni kisik oksidira proksimalne nukleofilne aminokiselinske ostatke, što rezultira umpolung polaritetom koji je elektrofilan i može dalje reagirati s nukleofilima aminske sonde16,17.Sonda je dizajnirana sa alkinskom ručkom koja omogućava hemiju klika i povlačenje prema dole za LC/MS/MS karakterizaciju.
Šematski prikaz označavanja proteinskih kompleksa posredovanih miniSOG.Kada su izložene plavoj svjetlosti, ćelije koje eksprimiraju miniSOG-POI generiraju singletni kisik, koji modificira proteine ​​u interakciji, ali ne i nevezujuće proteine.Intermedijarni proizvodi fotooksidacije presreću se relejnim oznakama hemijske sonde amina kako bi se formirali kovalentni adukti.Alkinil grupa na hemijskoj sondi omogućava hemiju klika za obogaćivanje povlačenjem nadole praćeno LC-MS/MS kvantitacijom.b Hemijska struktura aminskih sondi 1-4.c Reprezentativna fluorescentna gel analiza mitohondrijalnih lokalizovanih miniSOG-posredovanih proteomskih markera koristeći sonde 1-4 i relativnu kvantifikaciju zasnovanu na gel denzitometriji.Odnos signala i pozadine hemijskih sondi je procenjen korišćenjem eksperimenata negativne kontrole isključujući plavo svetlo ili korišćenjem HEK293T ćelija bez ekspresije miniSOG.n = 2 biološki nezavisna uzorka.Svaka tačka predstavlja biološku repliku.d Reprezentativno otkrivanje i kvantifikacija PDPL korišćenjem optimizovane sonde 3 u prisustvu ili odsustvu naznačenih PDPL komponenti kao što je c.n = 3 biološki nezavisna uzorka.Svaka tačka predstavlja biološku repliku.Središnje linije i brkovi predstavljaju srednju vrijednost i ± standardnu ​​devijaciju.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Konfokalno snimanje singletnog kiseonika sa daleko crvenom Si-DMA bojom.Skala bar: 10 µm.Gel i konfokalni eksperimenti su nezavisno ponovljeni najmanje dva puta sa sličnim rezultatima.
Prvo smo testirali sposobnost zrelih fotosenzibilizatora miniSOG26 i KillerRed23, stabilno eksprimiranih u HEK293T, da posreduju u propargilaminskom označavanju proteoma kao hemijske sonde (dopunska slika 1a).Analiza fluorescencije gela je pokazala da je obilježavanje cijelog proteoma postignuto korištenjem miniSOG-a i zračenja plavim svjetlom, dok s KillerRed-om nije uočen nikakav vidljiv proizvod za označavanje.Da bismo poboljšali omjer signala i pozadine, zatim smo testirali set hemijskih sondi koje sadrže anilin (1 i 3), propilamin (2) ili benzilamin (4).Primetili smo da same ćelije HEK293T imaju veći pozadinski signal u poređenju sa odsustvom plave svetlosti, verovatno zbog endogenog riboflavin fotosenzibilizatora, flavin mononukleotida (FMN) 27 . Hemijske sonde 1 i 3 na bazi anilina dale su bolju specifičnost, pri čemu HEK293T stabilno izražava miniSOG u mitohondrijima pokazujući >8 puta povećanje signala za sondu 3, dok je sonda 2 korištena u metodi označavanja RNA CAP-seq pokazuje samo ~2,5- višestruko povećanje signala, vjerovatno zbog različitih preferencija za reaktivnost između RNK i proteina (Slika 1b, c). Hemijske sonde 1 i 3 na bazi anilina dale su bolju specifičnost, pri čemu HEK293T stabilno izražava miniSOG u mitohondrijima pokazujući >8 puta povećanje signala za sondu 3, dok je sonda 2 korištena u metodi označavanja RNA CAP-seq pokazuje samo ~2,5- višestruko povećanje signala, vjerovatno zbog različitih preferencija za reaktivnost između RNK i proteina (Slika 1b, c).Hemijske sonde 1 i 3 na bazi anilina pokazale su bolju specifičnost: HEK293T, koji stabilno izražava miniSOG u mitohondrijama, pokazuje više od 8 puta povećanje signala za sondu 3, dok sonda 2, koja se koristi u metodi CAP-seq RNK označavanja, samo pokazuje ~2,5 puta povećanje signala, vjerovatno zbog različitih preferencija reaktivnosti između RNK i proteina (Slika 1b, c).基于 苯胺 的 化学 探针 的 特异性, hek293t 在 线 粒体 中 稳定 表达 Minizog, 探针 3 的 信号 增加> 8 倍, 而 用 于 于 标记 方法 Cap-Seq 的 探针 2 仅 显示 ~ ~ 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好 (图1b,c)。基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性, hek293t 在 粒体 中 稳定 表达 MiniSog, 探针 3 的 信号 增加 增加> 8 倍 而 于 于 于 增加 标记 Cap-eq 的 2 仅 ~ ~ ~ ~ 2.5 -倍信号增加,可能是由于RNAHemijske sonde 1 i 3 zasnovane na anilinu imale su bolju specifičnost, HEK293T je stabilno eksprimirao miniSOG u mitohondrijima, a sonda 3 imala je preko 8 puta povećanje signala, dok je sonda 2 za metodu označavanja CAP-seq RNK pokazala samo ~2,5 puta povećanje.u signalu, vjerovatno zbog različitih preferencija reakcija između RNK i proteina (slika 1b, c).Osim toga, testirani su izomeri sonde 3 i hidrazinske sonde (sonde 5, 6, 7), čime je potvrđena optimizacija sonde 3 (dodatna slika 1b,c).Slično, analiza fluorescencije u gelu otkrila je druge optimizovane eksperimentalne parametre: talasnu dužinu zračenja (460 nm), koncentraciju hemijske sonde (1 mM) i vreme zračenja (20 min) (dodatna slika 2a-c).Izostavljanje bilo koje komponente ili koraka u PDPL protokolu rezultiralo je značajnim preokretom signala u pozadini (slika 1d).Značajno je da je obilježavanje proteina značajno smanjeno u prisustvu natrijum azida ili troloksa, za koje je poznato da gase singletni kisik.Prisustvo D2O, za koji je poznato da stabilizuje singletni kiseonik, pojačava signal obeležavanja.Da bi se istražio doprinos drugih reaktivnih vrsta kiseonika obeležavanju, dodani su manitol i vitamin C da bi se uspostavili hvatači hidroksilnih i superoksidnih radikala, 18, 29, ali nije utvrđeno da smanjuju obeležavanje.Dodavanje H2O2, ali ne i osvjetljenje, nije rezultiralo označavanjem (dopunska slika 3a).Fluorescentno snimanje singletnog kiseonika sa Si-DMA sondama potvrdilo je prisustvo singletnog kiseonika u HEK293T-miniSOG žici, ali ne i u originalnoj HEK293T žici.Osim toga, mitoSOX Red nije mogao otkriti proizvodnju superoksida nakon osvjetljenja (Slika 1e i Dodatna slika 3b) 30. Ovi podaci snažno sugeriraju da je singletni kisik glavna reaktivna vrsta kisika odgovorna za naknadno proteomsko obilježavanje.Citotoksičnost PDPL-a je procijenjena uključujući zračenje plavim svjetlom i hemijske sonde, a nije uočena značajna citotoksičnost (dopunska slika 4a).
Da bismo proučili mehanizam obilježavanja i omogućili proteomsku identifikaciju proteinskih kompleksa korištenjem LC-MS/MS, prvo moramo odrediti koje su aminokiseline modificirane i delta masu oznaka sonde.Izvještava se da su metionin, histidin, triptofan i tirozin modificirani singletnim kisikom14,15.Integrišemo TOP-ABPP31 radni tok sa nepristrasnom otvorenom pretragom koju obezbeđuje FragPipe računarska platforma zasnovana na MSFragger32.Nakon modifikacije singletnog kiseonika i obeležavanja hemijskom sondom, izvedena je hemija klika korišćenjem etikete za redukciju biotina koja sadrži linker koji se može cepiti, nakon čega je usledilo istezanje neutravidina i digestija tripsina.Modifikovani peptid, koji je još vezan za smolu, fotocepljen je za LC-MS/MS analizu (slika 2a i dodatni podaci 1).Veliki broj modifikacija dogodio se u cijelom proteomu sa preko 50 navedenih podudaranja peptidnih mapa (PSM) (slika 2b).Iznenađujuće, primijetili smo samo modifikaciju histidina, vjerovatno zbog veće reaktivnosti oksidiranog histidina prema anilinskim sondama od ostalih aminokiselina.Prema objavljenom mehanizmu oksidacije histidina singletnim kisikom,21,33 predložena delta-masena struktura od +229 Da odgovara aduktu sonde 3 sa 2-okso-histidinom nakon dvije oksidacije, dok je +247 Da proizvod hidrolize od +229 Da (dopunska slika 5).Procjena MS2 spektra pokazala je visoku pouzdanost identifikacije većine y i b jona, uključujući identifikaciju modificiranih fragmenata jona (y i b) (slika 2c).Kontekstna analiza lokalne sekvence PDPL-modificiranih histidina otkrila je umjerenu preferenciju motiva za male hidrofobne ostatke na ±1 poziciji (dodatna slika 4b).U prosjeku je identificirano 1,4 histidina po proteinu, a mjesta ovih markera određena su analizom površine pristupačne otapala (SASA) i relativne dostupnosti otapala (RSA) (dodatna slika 4c,d).
Nepristrasan radni tok za proučavanje preostale selektivnosti koristeći FragPipe računarsku platformu koju pokreće MSFragger.Odcjepljivi linkeri se koriste u Click hemiji kako bi se omogućilo fotocijepanje modificiranih peptida iz streptavidin smole.Pokrenuta je otvorena pretraga kako bi se identifikovale brojne modifikacije, kao i relevantni ostaci.b Dodijelite masu modifikacija koje se javljaju u cijelom proteomu.Mapiranje peptida PSM.c MS2 spektralna anotacija histidinskih mjesta modificiranih sondom 3. Kao reprezentativan primjer, kovalentna reakcija sa sondom 3 dodala je +229,0938 Da modificiranoj aminokiselini.d Test mutacije koji se koristi za testiranje PDPL markera.PRDX3 (H155A, H225A) i PRDX1 (H10A, H81A, H169A) su transficirani plazmidima divljeg tipa za anti-Flag detekciju.e Sintetički peptid je reagovao sa prečišćenim miniSOG u prisustvu sonde 3 i odgovarajući proizvodi sa Δm +247 i +229 su zabeleženi u LC-MS spektru.f In vitro interakcije protein-protein modelirane sa miniSOG-6xHis-tagom i anti-6xHis antitelom.Antibiotin (streptavidin-HRP) i anti-mišja Western blot analiza kompleksa miniSOG-6xHis/anti-6xHis antitijela označenih sondom 3, ovisno o vremenu izlaganja svjetlu.Oznake za pojedinačne proteine ​​su izražene u odgovarajućoj molekularnoj težini: laki lanac LC antitela, teški lanac HC antitela.Ovi eksperimenti su nezavisno ponovljeni najmanje dva puta sa sličnim rezultatima.
Za biohemijsku verifikaciju mesta obeležavanja, PRDX3 i PRDX1 identifikovani masenom spektrometrijom su promenjeni iz histidina u alanin i upoređeni sa divljim tipom u testovima transfekcije.PDPL rezultati su pokazali da je mutacija značajno smanjila označavanje (slika 2d).U međuvremenu, peptidne sekvence identifikovane u otvorenom pretraživanju su sintetizovane i reagovale in vitro sa prečišćenim miniSOG u prisustvu sonde 3 i plave svetlosti, dajući proizvode sa pomakom mase od +247 i +229 Da kada su detektovani pomoću LC-MS (Slika 2e).).Da bismo testirali da li se proksimalni proteini u interakciji mogu označiti in vitro kao odgovor na fotoaktivaciju miniSOG, dizajnirali smo vještački test blizine interakcijom između miniSOG-6xHis proteina i anti-His monoklonskog antitijela in vitro (slika 2f).U ovom testu smo očekivali proksimalno obeležavanje teških i lakih lanaca antitela sa miniSOG.Zapravo, anti-miš (prepoznavanje teških i lakih lanaca anti-6xHis-obilježenih antitijela) i streptavidin Western blotovi pokazali su snažnu biotinilaciju teških i lakih lanaca.Posebno smo primijetili autobiotinilaciju miniSOG zbog oznake 6xHis i unakrsnih veza između lakih i teških lanaca, što može biti povezano s prethodno opisanim jazom između lizina i proksimalnog odgovora na 2-okso-histidin.U zaključku, zaključujemo da PDPL modificira histidin na način ovisan o blizini.
Naš sljedeći cilj bio je okarakterizirati subcelularni proteom kako bismo testirali specifičnost in situ obilježavanja.Stoga smo stabilno eksprimirali miniSOG u jezgru, mitohondrijskom matriksu ili vanjskoj ER membrani ćelija HEK293T (slika 3a).Analiza fluorescencije u gelu otkrila je obilje označenih traka na tri subcelularne lokacije, kao i različite obrasce označavanja (slika 3b).Fluorescentna imidž analiza pokazala je visoku specifičnost PDPL (slika 3c).PDPL radni tok praćen je reakcijama klika s rodaminskim bojama da bi se ocrtali subcelularni proteomi pomoću fluorescentne mikroskopije, a PDPL signali su kolokalizirani s DAPI, mitohondrijalnim tragačima ili ER trackerima, potvrđujući visoku vjernost PDPL-a.Za tri lokacije organela, paralelno poređenje PDPL-a sa TurboID-om korištenjem avidin western blot-a pokazalo je da je PDPL označen konkretnije u poređenju sa njihovim odgovarajućim kontrolama.U uslovima PDPL, pojavilo se više obeleženih traka, što ukazuje na više proteina obeleženih PDPL (dodatna slika 6a-d).
a Šematski prikaz obilježavanja proteoma specifičnog za organele posredovano miniSOG.miniSOG cilja mitohondrijsku matricu fuzijom na N-terminalne 23 aminokiseline ljudskog COX4 (mito-miniSOG), jezgro fuzijom na H2B (nukleus-miniSOG) i Sec61β preko citoplazmatske strane ER membrane (ER-miniSOG) ).Indikacije uključuju snimanje u gelu, konfokalno snimanje i masenu spektrometriju.b Reprezentativne gel slike tri PDPL profila specifična za organele.CBB Coomassie Brilliant Blue.c Reprezentativne konfokalne slike ćelija HEK293T koje stabilno eksprimiraju miniSOG sa različitim subćelijskim lokalizacijama otkrivenim antitijelom označenim V5 (crveno).Subcelularni markeri se koriste za mitohondrije i ER (zeleni).PDPL radni tok uključuje detekciju miniSOG (žuto) označenih subcelularnih proteoma korištenjem Cy3-azidne klik kemije.Skala bar: 10 µm.d Vulkanski dijagrami PDPL-označenih proteoma u različitim organelama kvantificirani neobilježenom kvantifikacijom (n = 3 nezavisna biološka eksperimenta).Dvostrani Studentov t-test je korišten na parcelama vulkana.HEK293T divlji tip je korišten kao negativna kontrola. Značajno izmijenjeni proteini su označeni crvenom bojom (p < 0,05 i >2-struka razlika u intenzitetu jona). Značajno izmijenjeni proteini su označeni crvenom bojom (p < 0,05 i >2-struka razlika u intenzitetu jona). Znači izmenjene bele koje izdvajaju crvenu boju (p < 0,05 i >2-kratna razlika u intenzivnosti jona). Značajno izmijenjeni proteini su istaknuti crvenom bojom (p < 0,05 i >2-struka razlika u intenzitetu jona).显着变化的蛋白质以红色突出显示 (p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）。).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 Znači, izmijenjene bijele boje izdvajaju crvenu boju (p < 0,05 i > 2-kratna raznica u jonskoj sili). Značajno izmijenjeni proteini su označeni crvenom bojom (p < 0,05 i > 2-struka razlika u jonskoj snazi).Srodni proteini važni za HEK293T-miniSOG, ali nisu važni za HEK293T prikazani su zelenom bojom.e Analiza specifičnosti proteomskih skupova podataka iz eksperimenata d.Ukupan broj statistički značajnih proteina u svakoj organeli (crvene i zelene tačke) je označen na vrhu.Histogrami pokazuju proteine ​​lokalizovane u organelama na osnovu MitoCarta 3.0, GO analize i A. Ting et al.ljudi.Odvojeni skupovi podataka za mitohondrije, jezgre i ER.Ovi eksperimenti su nezavisno ponovljeni najmanje dva puta sa sličnim rezultatima.Sirovi podaci se pružaju u obliku datoteka sirovih podataka.
Podstaknuta rezultatima gela i snimanja, kvantifikacija bez oznaka korištena je za kvantificiranje identificiranog proteoma u svakoj organeli (dodatni podaci 2).Netransficirani HEK293T korišten je kao negativna kontrola za oduzimanje pozadinskih markera. Analiza vulkanskog grafikona pokazala je značajno obogaćene proteine ​​(p < 0,05 i >2-struki intenzitet jona) kao i singleton proteine ​​koji su prisutni samo u linijama koje eksprimiraju miniSOG (slika 3d crvene i zelene tačke). Analiza vulkanskog grafikona pokazala je značajno obogaćene proteine ​​(p < 0,05 i >2-struki intenzitet jona) kao i singleton proteine ​​koji su prisutni samo u linijama koje eksprimiraju miniSOG (slika 3d crvene i zelene tačke). Analizirana grafika vulkana pokazala je znatno obogaćene bijele boje (p <0, 05 i > 2-kratna intenzivnost jona), kao i odinočne bijele boje, koje su prisutne samo u liniji, ekspresirajući miniSOG (ris. 3d, crvena i zelena točka). Analiza vulkanskog grafikona pokazala je značajno obogaćene proteine ​​(p<0,05 i >2-struki intenzitet jona) kao i pojedinačne proteine ​​koji su prisutni samo u linijama koje eksprimiraju miniSOG (slika 3d, crvene i zelene tačke).火山图 分析 显示 出 显着 富集 的 (p <0,05 和> 2 倍 离子 强度) 以及 仅 存 在于 Minizog 表达 系 中 的 单一 蛋白质 (图 3D 红色 和 绿色点).火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 (p <0,05 和> 2 倍 离子 强度) 仅 存 在于 在于 Minizog 表达 系 的 单一 蛋白质 (图 3D 红色 绿色点 ...))))))))))))))))))))))))) Analiz grafike vulkana pokazao je značajne obogaćene bijele boje (p <0, 05 i> 2x jonska sila), kao i odvojene bijele boje, samo u ekspresionoj liniji miniSOG (crvene i zelene točke na slici 3d). Analiza vulkanskog grafikona otkrila je značajno obogaćene proteine ​​(p<0,05 i >2x jonske snage) kao i pojedinačne proteine ​​prisutne samo u ekspresijskoj liniji miniSOG (crvene i zelene tačke na slici 3d).Kombinirajući ove podatke, identificirali smo 1364, 461 i 911 statistički značajnih nuklearnih, mitohondrijalnih i ER proteina vanjske membrane, respektivno.Da bismo analizirali tačnost PDPL lokalizovane organelom, koristili smo MitoCarta 3.0, analizu genske ontologije (GO) i A. Ting et al.skup podataka8 je korišten za mitohondrije, jezgro i ER za testiranje specifičnosti organela otkrivenih proteina, što odgovara preciznosti od 73,4, 78,5 i 73,0% (slika 3e).Specifičnost PDPL potvrđuje da je PDPL idealan alat za identifikaciju proteoma specifičnih za organele.Značajno, submitohondrijalna analiza identifikovanih mitohondrijalnih proteina pokazala je da je zarobljeni proteom uglavnom raspoređen u matriksu i unutrašnjoj membrani (226 i 106, respektivno), čineći 91,7% (362) od ukupnog broja identifikovanih mitohondrijalnih proteina.dodatno je potvrđen visok nivo PDPL-a (dopunska slika 7a).Slično, subnuklearna analiza je pokazala da je uhvaćeni proteom uglavnom raspoređen u jezgru, nukleoplazmu i jezgro (dodatna slika 7b).Nuklearna proteomska analiza sa signalnim peptidom nuklearne lokalizacije (3xNLS) pokazala je sličnu točnost kao i H2B konstrukt (dodatna slika 7c-h).Da bi se odredila specifičnost PDPL markera, nuklearni laminin A je odabran kao diskretno lokalizirana POI7 zamka.PDPL je identifikovao 36 značajno obogaćenih proteina, od kojih su 12 proteina (30,0% uključujući lamin A) bili dobro okarakterisani proteini koji interaguju sa laminom A označeni u bazi podataka String, sa većim procentom od BioID metode (122 proteina) 28 od 28. , 22.9 %) 7. Naša metoda je identificirala manje proteina, vjerovatno zbog ograničenih područja obilježavanja, što je omogućeno aktivnijim singletnim kisikom.GO analiza je pokazala da se identificirani proteini uglavnom nalaze u nukleoplazmi (26), nuklearnoj membrani (10), nuklearnoj membrani (9) i nuklearnim porama (5).Zajedno, ovi nuklearno-lokalizirani proteini činili su 80% obogaćenih proteina, dodatno demonstrirajući specifičnost PDPL-a (dodatna slika 8a-d).
Nakon što smo utvrdili sposobnost PDPL-a da izvrši obilježavanje blizine u organelama, zatim smo testirali da li se PDPL može koristiti za analizu partnera koji se vezuju za POI.Konkretno, nastojali smo definirati PDPL analizu citosolnih proteina, koji se smatraju težim ciljevima od njihovih membranski lokaliziranih kolega zbog njihove vrlo dinamične prirode.Bromodomen i ekstraterminalni (BET) protein BRD4 privukao je našu pažnju zbog svoje ključne uloge u raznim bolestima 35, 36 .Kompleks koji formira BRD4 je koaktivator transkripcije i važan terapeutski cilj.Regulacijom ekspresije c-myc i Wnt5a faktora transkripcije, smatra se da je BRD4 ključna determinanta akutne mijeloične leukemije (AML), multiplog mijeloma, Burkittovog limfoma, raka debelog crijeva i upalnih bolesti37,38.Osim toga, neki virusi ciljaju BRD4 da regulišu virusnu i ćelijsku transkripciju, kao što su papiloma virus, HIV i SARS-CoV-236,39.
Da bismo mapirali interakciju BRD4 koristeći PDPL, kombinovali smo miniSOG sa kratkom N- ili C-terminalnom izoformom BRD4.Proteomski rezultati su otkrili visok stepen preklapanja između ova dva konstrukta (dodatna slika 9a).Nuklearni proteom identificiran sa miniSOG-H2B pokriva 77,6% proteina koji stupaju u interakciju s BRD4 (dopunska slika 9b).Zatim su različita vremena osvjetljenja (2, 5, 10, 20 min) korištena za podešavanje polumjera markera (slika 4a i dodatni podaci 3).Zaključujemo da će u kraćim fotoperiodima PDPL prvenstveno označavati direktno vezujuće partnere, dok će duži periodi uključivati ​​proteine ​​identificirane tokom kraćih perioda fotoaktivacije, kao i indirektne mete u kompleksima za obilježavanje.U stvari, pronašli smo snažno preklapanje između susjednih vremenskih tačaka (84,6% za 2 i 5 minuta; 87,7% za 5 i 10 minuta; 98,7% za 10 i 20 minuta) (Slika 4b i Dodatna slika 9c).U svim eksperimentalnim grupama, pronašli smo ne samo BRD4 samooznačavanje, već i nekoliko poznatih meta kao što su MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A i HMGB1 označene u bazi podataka nizova.Jonska snaga ovih meta je proporcionalna vremenu ekspozicije (slika 4c i dodatna slika 9d).GO analiza proteina identificiranih u 2-minutnoj grupi pokazala je da su identificirani proteini lokalizirani u jezgri i da su uključeni u remodeliranje hromatina i funkciju RNA polimeraze.Molekularna funkcija proteina obogaćena je vezivanjem hromatina ili transkripcionom koaktivacijom, u skladu sa funkcijom BRD4 (slika 4d).Analiza interakcije proteina omogućena u bazi podataka nizova otkrila je prvi nivo indirektnih interakcija između BRD4 i HDAC familije interakcionih kompleksa kao što su SIN3A, NCOR2, BCOR i SAP130 (Slika 4e i Dodatna slika 9e), u skladu sa BRD4 i HDAC vezujućim acetiliranim histonima ..Pored toga, reprezentativne mete identifikovane pomoću LC-MS/MS, uključujući Sin3A, NSUN2, Fus i SFPQ, potvrđene su Western blotingom (slika 4f).Nedavno je objavljeno da kratka izoforma BRD4 formira jezgra sa svojstvima razdvajanja faza tečnost-tečnost (LLPS).RNK vezujući proteini Fus i SFPQ posreduju u LLPS-u različitih ćelijskih procesa i ovdje su identificirani kao nezabilježeni BRD4 vezujući proteini.Interakcija između BRD4 i SFPQ potvrđena je eksperimentima ko-imunoprecipitacije (co-IP) (Slika 4g), što sugerira još jedan mehanizam za razdvajanje faza tekućina-tečnost posredovano BRD4 koji zaslužuje dalje istraživanje.Uzeti zajedno, ovi rezultati sugeriraju da je PDPL idealna platforma za identifikaciju poznatih BRD4 interakcija, kao i nepoznatih vezujućih proteina.
a Šematski prikaz BRD4 označavanja blizine posredovane miniSOG, vremena ekspozicije: 2, 5, 10 i 20 min.b Preklapanje proteina identifikovanih u različitim vremenima osvetljenja.Obogaćivanje proteinima identifikovano u HEK293T-miniSOG-BRD4 bilo je statistički značajno u poređenju sa divljim tipom HEK293T.c Intenzitet jona kada se kvantifikuju neobeleženi reprezentativni poznati BRD4-vezujući proteini tokom određenog vremena izlaganja.n = 3 biološki nezavisna uzorka.Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± standardna devijacija.d Genska ontološka analiza (GO) proteina identifikovanih u 2-minutnoj grupi.Navedeno je prvih deset GO pojmova.Mjehurići su obojeni prema kategoriji GO termina, a veličina mjehurića je proporcionalna broju proteina koji se nalaze u svakom pojmu.e Analiza nizova proteina u interakciji sa BRD4.Žuti krugovi su direktno ljepilo, a sivi krugovi su prvi sloj indirektnog ljepila.Crvene linije predstavljaju eksperimentalno određene interakcije, a plave linije predstavljaju predviđene interakcije.f Reprezentativni ciljevi vezivanja BRD4 identifikovani u LC-MS/MS verifikovani su Western blot-om.g Eksperimenti ko-imunoprecipitacije potvrđuju interakciju između SFPQ i BRD4.Ovi eksperimenti su nezavisno ponovljeni najmanje dva puta sa sličnim rezultatima.Sirovi podaci se pružaju u obliku datoteka sirovih podataka.
Pored identifikacije neregistriranih ciljeva povezanih s POI, pretpostavljamo da će PDPL biti prikladan za identifikaciju supstrata za enzime, što bi zahtijevalo karakterizaciju indirektnih veznih proteina u velikim kompleksima za označavanje neregistriranih supstrata.Parkin (kodiran sa PARK2) je E3 ligaza i poznato je da mutacije u parkinu uzrokuju autosomno recesivnu juvenilnu Parkinsonovu bolest (AR-JP)42.Osim toga, parkin je opisan kao bitan za mitofagiju (mitohondrijalnu autofagiju) i uklanjanje reaktivnih vrsta kisika.Međutim, iako je identificirano nekoliko supstrata parkina, uloga parkina u ovoj bolesti ostaje nejasna.Da bi se označili njegovi nekarakteristični supstrati, PDPL je testiran dodavanjem miniSOG na N- ili C-terminus parkina.Ćelije su tretirane transporterom protona karbonil cijanida m-klorofenilhidrazonom (CCCP) da bi se aktivirao parkin putem PINK1-Parkin puta.U poređenju s našim BRD4 PDPL rezultatima, fuzija N-terminusa parkina otkrila je veći skup ciljnih proteina, iako je pokrivala veći dio C-terminusa (177 od 210) (slika 5a,b i dodatni podaci 4).rezultat je u skladu s izvještajima da N-terminalne oznake mogu nenormalno aktivirati Parkin44.Iznenađujuće, bilo je samo 18 preklapajućih proteina u našim podacima s objavljenim AP-MS rezultatima za Parkin43, vjerovatno zbog razlika između ćelijskih linija i proteomskih tokova rada.Pored četiri poznata proteina (ARDM1, HSPA8, PSMD14 i PSMC3) identifikovana pomoću dve metode (slika 5c)43.Za dalju validaciju rezultata LC-MS/MS, PDPL tretman i naknadni Western blot korišćeni su za poređenje rezultata HEK293T testa roditeljskih ćelija i stabilne N-terminalne linije parkina.Prethodno nepoznate mete CDK2, DUT, CTBP1 i PSMC4 testirane su sa poznatim vezivom, DNAJB1 (slika 5d).
Vulkanski dijagram proteina u interakciji s parkinom u ćelijama HEK293T sa stabilno eksprimiranim miniSOG spojenim na N- ili C-terminus parkina (n = 3 nezavisna biološka eksperimenta).Dvostrani Studentov t-test je korišten na parcelama vulkana.HEK293T je korišten kao negativna kontrola. Značajno izmijenjeni proteini su označeni crvenom bojom (p < 0,05 i >2-struka razlika u intenzitetu jona). Značajno izmijenjeni proteini su označeni crvenom bojom (p < 0,05 i >2-struka razlika u intenzitetu jona). Znači izmenjene bele koje izdvajaju crvenu boju (p < 0,05 i >2-kratna razlika u intenzivnosti jona). Značajno izmijenjeni proteini su istaknuti crvenom bojom (p < 0,05 i >2-struka razlika u intenzitetu jona).显着变化的蛋白质以红色突出显示 (p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）。).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 Znači, izmijenjene bijele boje izdvajaju crvenu boju (p < 0,05 i > 2-kratna raznica u jonskoj sili). Značajno izmijenjeni proteini su označeni crvenom bojom (p < 0,05 i > 2-struka razlika u jonskoj snazi).Srodni proteini važni za HEK293T-miniSOG, ali nisu važni za HEK293T prikazani su zelenom bojom.b Venov dijagram koji prikazuje preklapajuće proteine ​​između N-terminalnih i C-terminalnih konstrukcija.N-terminalne oznake mogu aberantno aktivirati parkin i rezultirati prepoznatljivijim proteinima.c Venov dijagram koji prikazuje preklapajuće proteine ​​između PDPL i AP-MS.Navedeni su poznati interaktori, uključujući 4 od 18 preklapajućih proteina i 11 od 159 proteina specifično identifikovanih u PDPL.d Reprezentativni ciljevi identifikovani pomoću LC-MS/MS verifikovani su Western blottingom.e Ssu72 i SNW1 identifikovani su kao neregistrovani parkin supstrati.Ovi FLAG-označeni proteinski plazmidi su transficirani u HEK293T i HEK293T-Parkin-miniSOG nakon čega je uslijedio CCCP tretman u različitim vremenskim točkama.Degradacija je bila izraženija u liniji prekomjerne ekspresije Parkina.f Koristeći inhibitor proteasoma MG132, potvrđeno je da je proces degradacije Ssu72 i SNW1 posredovan proteazom-ubikvitinacijom.Ovi eksperimenti su nezavisno ponovljeni najmanje dva puta sa sličnim rezultatima.Sirovi podaci se pružaju u obliku datoteka sirovih podataka.
Značajno je da proteini identificirani PDPL-om moraju uključivati ​​proteine ​​koji se vezuju za parkin i njihove supstrate.Da bismo otkrili neregistrirane parkin supstrate, odabrali smo sedam identificiranih proteina (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 i SNW1) i transficirane plazmide kako bismo izložili ove gene normalnom HEK293T i stabilno eksprimirali miniSOG-Parkinov tretman praćen HEK29.Nivoi Ssu72 i SNW1 proteina su značajno smanjeni u stabilnoj miniSOG-Parkin liniji (slika 5e).Tretman sa CCCP u trajanju od 12 sati rezultirao je najznačajnijom degradacijom oba supstrata.Da bi se istražilo da li je degradacija Ssu72 i SNW1 regulisana proteazomskom ubikvitinacijom, dodat je inhibitor proteasoma MG132 da inhibira aktivnost proteasoma, i zapravo smo otkrili da je njihov proces degradacije inhibiran (slika 5f).Dodatni ciljevi koji nisu supstrati potvrđeni su kao Parkin interaktori korištenjem Western blotting-a (dopunska slika 10), što je pokazalo konzistentne rezultate sa LC-MS/MS.U zaključku, integracija PDPL radnog toka sa verifikacijom transfekcije ciljnog proteina omogućava identifikaciju neregistrovanih supstrata E3 ligaze.
Razvili smo zajedničku platformu za označavanje blizine koja vam omogućava da identifikujete tačke interesa u interakciji u prostoru i vremenu.Platforma je zasnovana na miniSOG fotosenzibilizator proteinu, koji je samo oko 12 kDa, manje od polovine veličine zrelog enzima APEX2 (27 kDa) i jedne trećine veličine TurboID (35 kDa).Manja veličina bi trebala uvelike proširiti raspon primjena za proučavanje malih proteinskih interaktoma.Dalje istraživanje dodatnih fotosenzibilizatora, bilo genetski kodiranih proteina ili malih molekula, potrebno je da bi se povećao kvantni prinos singletnog kisika i proširila osjetljivost ovog pristupa.Za trenutnu verziju miniSOG-a, visoka vremenska rezolucija se može postići korištenjem plavog osvjetljenja za aktiviranje markera blizine.Osim toga, duže vrijeme izlaganja oslobodilo je veći „oblak“ singletnog kisika, što je rezultiralo modifikacijom distalnijih ostataka histidina, povećanim radijusom obilježavanja i mogućnošću finog podešavanja prostorne rezolucije PDPL-a.Također smo testirali sedam hemijskih sondi kako bismo povećali omjer signala i pozadine i istražili molekularni mehanizam koji stoji iza ovog pristupa.TOP-ABPP radni tok u kombinaciji sa nepristrasnim otvorenim pretraživanjem potvrdio je da su se modifikacije dogodile samo u histidinima i da nije uočeno konzistentno mikrookruženje za povećane modifikacije histidina, osim umjerene preferencije za histidinima u području petlje.
PDPL se također koristio za karakterizaciju subcelularnih proteoma sa specifičnošću proteoma i pokrivenošću koja je barem uporediva s drugim metodama obilježavanja blizine i metoda kemijske sonde specifične za organele.Markeri blizine su također uspješno korišteni za karakterizaciju površinskih, lizozomalnih i proteoma povezanih sa sekretomom46,47.Vjerujemo da će PDPL biti kompatibilan sa ovim subćelijskim organelama.Osim toga, izazvali smo PDPL identificiranjem ciljeva za vezivanje citosolnog proteina koji su složeniji od proteina vezanih za membranu zbog njihovih dinamičkih svojstava i uključenosti u više vremenskih interakcija.PDPL je primijenjen na dva proteina, transkripcijski koaktivator BRD4 i ligazu E3 Parkin povezanu sa bolešću.Ova dva proteina odabrana su ne samo zbog njihovih osnovnih bioloških funkcija, već i zbog njihove kliničke važnosti i terapeutskog potencijala.Za ove dvije POI identifikovani su dobro poznati obavezujući partneri kao i neregistrovani ciljevi.Značajno je da je protein SFPQ povezan sa razdvajanjem faza potvrđen od strane ko-IP, što može ukazivati ​​na novi mehanizam kojim BRD4 (kratka izoforma) reguliše LLPS.Istovremeno, vjerujemo da je identifikacija Parkin supstrata scenarij u kojem je potrebna identifikacija indirektnih ljepila.Identificirali smo dva neidentificirana supstrata parkina i potvrdili njihovu degradaciju duž puta ubikvitinacije-proteasoma.Nedavno je razvijena strategija hvatanja zasnovana na mehanizmu za otkrivanje hidrolaznih supstrata hvatanjem ih enzimima.Iako je ovo vrlo moćna metoda, nije prikladna za analizu supstrata uključenih u formiranje velikih kompleksa i zahtijeva stvaranje kovalentnih veza između enzima i supstrata.Očekujemo da se PDPL može proširiti na proučavanje drugih proteinskih kompleksa i familija enzima, kao što su familije deubikvitinaze i metaloproteaze.
Novi oblik miniSOG-a, nazvan SOPP3, je razvijen sa poboljšanom proizvodnjom singletnog kiseonika.Uporedili smo miniSOG sa SOPP3 i otkrili poboljšane performanse označavanja, iako je omjer signal-šum ostao nepromijenjen (dopunska slika 11).Pretpostavili smo da bi optimizacija SOPP3 (npr. kroz usmjerenu evoluciju) dovela do efikasnijih fotosenzibilizatorskih proteina koji zahtijevaju kraće svjetlosno vrijeme i time omogućavaju hvatanje dinamičnijih ćelijskih procesa.Značajno je da je trenutna verzija PDPL-a ograničena na ćelijsko okruženje jer zahtijeva plavo svjetlo i ne može prodrijeti u duboka tkiva.Ova karakteristika onemogućava njegovu upotrebu u studijama na životinjskim modelima.Međutim, kombinacija optogenetike sa PDPL mogla bi pružiti priliku za istraživanje na životinjama, posebno u mozgu.Osim toga, drugi infracrveni fotosenzibilizatori također uklanjaju ovo ograničenje.Istraživanja su trenutno u toku u ovoj oblasti.
Ćelijska linija HEK293T je dobijena od ATCC (CRL-3216).Ćelijska linija je bila negativna na infekciju mikoplazmama i uzgajana je u DMEM (Thermo, #C11995500BT) sa dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS, Vistech, #SE100-B) i 1% penicilina/streptomicina (Hyclone, #SV30010).odrastao u.
3-Aminofenilen (uzorak 3) i (4-etinilfenil)metanamin (uzorak 4) kupljeni su od Bidepharma.Propilamin (sonda 2) je kupljen od Energy-chemicals.N-(2-Aminofenil)pent-4-inamid (sonda 1) sintetiziran je prema objavljenim metodama.
Dodatna tabela 1 navodi genetske konstrukcije korištene u ovoj studiji.MiniSOG i KillerRed sekvence su klonirane iz poklona plazmida sa P. Zoua (Pekinški univerzitet).Ciljna sekvenca mitohondrijalnog matriksa izvedena je iz 23 N-terminalne aminokiseline COX4 i klonirana u naznačene vektore korištenjem Gibsonovog sklopa (Beyotime, #D7010S).Za ciljanje na membranu i jezgro endoplazmatskog retikuluma, SEC61B ljudska DNK (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) amplificirana PCR-om iz cDNA biblioteke HEK293T ćelija i H2B DNK (donirala D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) i klonirani, kao što je gore spomenuto.Osim ako nije drugačije naznačeno, drugi proteinski geni koji se koriste za transfekciju i izgradnju stabilnih ćelijskih linija su PCR amplificirani iz HEK293T ćelijske cDNA biblioteke.G3S (GGGS) i G4S (GGGGS) su korišteni kao linkeri između proteina mamaca i miniSOG.Oznaka epitopa V5 (GKPIPNPLLGLDST) dodata je ovim fuzionim konstruktima.Za ekspresiju kod sisara i uspostavljanje stabilne ćelijske linije, miniSOG fuzioni konstrukt je subkloniran u pLX304 lentivirusni vektor.Za ekspresiju bakterija, miniSOG je kloniran u pET21a vektor označen 6xHis na C-terminusu.
HEK293T ćelije su zasijane u količini od 2,0 x 105 ćelija po jažici u ploče sa šest jažica i transficirane 24 sata kasnije sa rekombinantnim lentivirusnim plazmidima (2,4 μg pLX304) i plazmidima za pakovanje virusa (1,5 μg psPAX2 i 1,2 μg psPAX2 i 1,2 μg LipoG080) , #C0533), oko 80% fuzije.Nakon transfekcije preko noći, podloga je promijenjena i inkubirana još 24 sata.Sakupljanje virusa je obavljeno nakon 24, 48 i 72 sata.Prije infekcije ciljnih ćelijskih linija, virusni medij je filtriran kroz filter od 0,8 μm (Merck, #millex-GP) i dodan je polibren (Solarbio, #H8761) do koncentracije od 8 μg/ml.Nakon 24 sata, ćelije su ostavljene da se oporave promjenom podloge.Ćelije su odabrane upotrebom 5 μg/ml blasticidina (Solarbio, #3513-03-9) za prva tri pasusa kao niži strogi odabir.Zatim se koristi 20 μg/ml kao stroži režim za sljedeća tri pasusa.
Ćelije su zasijane u komore sa 12 jažica (Ibidi, #81201) pri gustini od približno 20.000 ćelija po jažici.Da biste poboljšali adheziju ćelija HEK293T, dodajte 50 µg/ml fibronektina (Corning, #356008) razrijeđenog u fiziološkom rastvoru sa fosfatnim puferom (PBS, Sangon, #B640435) na 37°C.Komore su prethodno tretirane 1 sat, a zatim uklonjene sa PBS.Nakon 24 h, ćelije su jednom isprane PBS-om, inkubirane sa 1 mM sondom 3 u svježem Hanksovom izbalansiranom rastvoru soli (HBSS, Gibco, #14025092) 1 h na 37°C, a zatim inkubirane sa plavom LED diodom (460 nm). ).) zračeni su 10 minuta na sobnoj temperaturi.Nakon toga, ćelije su dva puta isprane sa PBS i fiksirane sa 4% formaldehida u PBS (Sangon, #E672002) 15 minuta na sobnoj temperaturi.Višak formaldehida je uklonjen iz fiksnih ćelija ispiranjem tri puta sa PBS.Ćelije su zatim permeabilizirane sa 0,5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) u PBS-u i isprane 3 puta sa PBS-om.Zatim uklonite komoru i svakom uzorku dodajte 25 µl reakcijske smjese klika koja sadrži 50 µM Cy3-azida (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) i 0,5 mg/ml natrijum askorbata (Aladdin, br. S105024) i inkubirano 30 minuta na sobnoj temperaturi.Nakon brze reakcije, ćelije su isprane šest puta sa PBS-om koji sadrži 0,05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST), a zatim blokirane sa 5% BSA (Abcone, #B24726) u PBST-u 30 minuta na sobnoj temperaturi.
Za kolokalizacijsko imunobojenje, ćelije su inkubirane sa primarnim antitelima prema naznačenim uslovima: mišji anti-V5 tag mAb (1:500, CST, #80076), zečji anti-Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), zečje poliklonsko anti-kalneksinsko antitelo (1:500, Abcam, #ab22595) ili zečje anti-lamin A/C monoklonsko antitelo (1:500; CST, #2032) na 4 °C preko noći.Nakon 3 puta ispiranja sa PBST, ćelije su inkubirane sa sekundarnim antitelima: kozji anti-zečji Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) razblažen 1:1000, kozji anti-miš Alexa Fluor 594 (CST, #8889) razblažen 1:1000.razrjeđivanje Razrijediti na sobnoj temperaturi 30 minuta.Ćelije su zatim isprane 3 puta sa PBST i obojene sa DAPI (Thermo, #D1306) u PBS-u 10 minuta na sobnoj temperaturi.Nakon 3 ispiranja sa PBS-om, ćelije su zatvorene u 50% glicerola (Sangon, #A600232) u PBS-u za snimanje.Imunofluorescentne slike su dobijene korišćenjem konfokalnog mikroskopa ZEISS LSM 900 Airyscan2 i softvera ZNE 3.5.
Za fluorescentno snimanje singletnog kiseonika, ćelije su dva puta isprane Hanks HEPES puferom pre dodavanja 100 nM Si-DMA u Hanks HEPES pufer (DOJINDO, #MT05).Nakon izlaganja svjetlu, ćelije su inkubirane u CO2 inkubatoru na 37°C 45 minuta.Ćelije su zatim dva puta isprane Hanksovim HEPES puferom i obojene Hoechstom u Hanksovom HEPES puferu 10 minuta na sobnoj temperaturi i vizualizirane pomoću ZEISS LSM 900 konfokalnog mikroskopa., #M36008) u HBSS puferu koji sadrži kalcijum i magnezijum.Nakon izlaganja svjetlu ili doksorubicinu (MCE, #HY-15142A), ćelije su inkubirane u CO2 inkubatoru na 37°C 10 minuta, isprane dva puta sa HBSS puferom i inkubirane sa Hoechstom u HBSS puferu na sobnoj temperaturi.minuta.Doksorubicin je korišten kao pozitivna kontrola sonde gdje su ćelije tretirane sa 20 μM doksorubicina u HBSS koji sadrži 1% BSA tokom 30 minuta.Imunofluorescentne slike su dobijene korišćenjem Zeiss LSM 900 konfokalnog mikroskopa.
Ćelije HEK293T koje stabilno eksprimiraju mito-miniSOG zasijane su pri gustini od približno 30% u posude od 15 cm.Nakon 48 sati, kada je postignuto ~80% konfluencije, ćelije su jednom isprane PBS-om, inkubirane sa 1 mM sondom 3 u svježem HBSS puferu 1 sat na 37°C, a zatim osvijetljene plavom LED diodom 10 minuta u sobi. temperatura..Nakon toga, ćelije su dva puta isprane PBS-om, ostrugane i resuspendirane u ledeno hladnom PBS puferu koji sadrži inhibitore proteaze bez EDTA (MCE, #HY-K0011).Ćelije su lizirane sonikacijom vrha u trajanju od 1 minute (1 sekunda uključena i 1 sekunda isključena pri 35% amplitude).Dobivena smjesa je centrifugirana na 15,871 xg 10 minuta na 4°C da bi se uklonili ostaci, a koncentracija supernatanta je podešena na 4 mg/mL korištenjem kompleta za analizu BCA proteina (Beyotime, #P0009).Kombinujte 1 ml gornjeg lizata sa 0,1 mM fotorazgradivog biotin azida (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0,1 mM TBTA liganda (Aladdin, #T162437) i 1 incubM CuSO4 mm rotirati 1 sat na sobnoj temperaturi.Nakon brze reakcije, dodajte smjesu u prethodno pomiješani rastvor (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) u staklenoj bočici od 10 ml.Uzorci su pomiješani i centrifugirani na 4500 g 10 minuta na sobnoj temperaturi.Donji i gornji rastvor su odbačeni, talog je dva puta ispran sa 1 ml metanola i centrifugiran na 15871×g 5 minuta na 4°C.Dodajte 1 ml 8 M uree (Aladdin, br. U111902) u 25 mM amonijum bikarbonata (ABC, Aladdin, br. A110539) da biste rastvorili talog.Uzorci su rekonstituisani sa 10 mM ditiotreitola (Sangon, #A100281 u 25 mM ABC) tokom 40 minuta na 55°C, nakon čega je dodat 15 mM svežeg jodoacetamida (Sangon, #A600539) na sobnoj temperaturi u mraku.Alkilacija u roku od 30 minuta..Dodatnih 5 mM ditiotreitola je dodano da se zaustavi reakcija.Pripremite približno 100 µl NeutrAvidin agaroznih kuglica (Thermo, #29202) za svaki uzorak ispiranjem 3 puta sa 1 ml PBS-a.Gore navedeni rastvor proteoma je razrijeđen sa 5 ml PBS-a i inkubiran sa prethodno ispranim zrncima NeutrAvidin agaroze 4 sata na sobnoj temperaturi.Perle su zatim isprane 3 puta sa 5 ml PBS koji sadrži 0,2% SDS (Sangon, #A600485), 3 puta sa 5 ml PBS koji sadrži 1M ureu i 3 puta sa 5 ml ddH2O.Zrnca su zatim sakupljena centrifugiranjem i resuspendovana u 200 μl 25 mM ABC koji sadrži 1 M ureu, 1 mM CaCl 2 (Macklin, #C805228) i 20 ng/μl tripsina (Promega, #V5280).Tripsinizirati preko noći na 37°C uz rotaciju.Reakcija je zaustavljena dodavanjem mravlje kiseline (Thermo, # A117-50) dok pH nije dostigao 2-3.Perle su isprane 3 puta sa 1 ml PBS koji sadrži 0,2% SDS, 3 puta sa 1 ml PBS koji sadrži 1 M ureu, a zatim 3 puta sa 1 ml destilovane vode.Modifikovani peptidi su oslobođeni svetlosnom lizom (365 nm) tokom 90 minuta upotrebom 200 μl 70% MeOH.Nakon centrifugiranja, supernatant je sakupljen.Zrnca su zatim jednom isprana sa 100 μl 70% MeOH i supernatanti su spojeni.Uzorci su sušeni u Speedvac vakuum koncentratoru i čuvani na -20°C do analize.
Da bi se identifikovali i kvantifikovali singlet kiseonikom modifikovani peptidi, uzorci su ponovo rastvoreni u 0,1% mravlje kiseline i 1 μg peptida je analizirano korišćenjem Orbitrap Fusion Lumos Tribrid masenog spektrometra opremljenog nano ESI izvorom od Tune i Xcalibur softvera dobavljača 4.3.Uzorci su razdvojeni na kapilarnoj koloni veličine 75 µm × 15 cm sa unutrašnje strane sa 3 µm C18 materijalom (ReproSil-pur, #r13.b9.) i povezani na EASY-nLC 1200 UHPLC sistem (Thermo).Peptidi su razdvojeni linearnom 95-minutnom gradijentom hromatografijom od 8% rastvarača B do 50% rastvarača B (A = 0,1% mravlje kiseline u vodi, B = 0,1% mravlje kiseline u 80% acetonitrila), a zatim linearno povećani na 98% B min. u 6 min pri brzini protoka od 300 nl/min.Orbitrap Fusion Lumos prikuplja podatke naizmjenično između potpunog MS skeniranja i MS2 skeniranja ovisno o podacima.Napon raspršivanja je postavljen na 2,1 kV, a temperatura kapilare za transport jona bila je 320°C.MS spektri (350-2000 m/z) su prikupljeni sa rezolucijom od 120,000, AGC 4 × 105, i maksimalnim ulaznim vremenom od 150 ms.10 najčešćih višestruko nabijenih prekursora u svakom punom skeniranju je fragmentirano korištenjem HCD-a sa normaliziranom energijom sudara od 30%, kvadrupolnim izolacijskim prozorom od 1,6 m/z i postavkom rezolucije od 30 000.AGC cilj za tandem masenu spektrometriju koristeći 5×104 i maksimalno ulazno vrijeme 150 ms.Dinamički izuzetak je postavljen na 30 sekundi. Nedodijeljeni joni ili oni sa nabojem od 1+ i >7+ odbijeni su za MS/MS. Nedodijeljeni joni ili oni sa nabojem od 1+ i >7+ odbijeni su za MS/MS. Neznačeni joni ili joni sa zaporkom 1+ i >7+ bili su otklonjeni za MS/MS. Nedodijeljeni joni ili joni sa nabojem od 1+ i >7+ su odbijeni za MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Neukazani joni ili joni sa zaradom 1+ i >7+ bili su otklonjeni za MS/MS. Nespecificirani joni ili joni sa nabojem od 1+ i >7+ su odbijeni za MS/MS.
Sirovi podaci se obrađuju pomoću FragPipe računarske platforme zasnovane na MSFraggeru.Odstupanja mase i odgovarajuće aminokiseline određene su korištenjem otvorenog algoritma pretraživanja s tolerancijom mase prekursora od -150 do 500 Da.Modifikovani peptidi su zatim identifikovani korišćenjem histidinskih modifikacija sa povećanjem mase od +229,0964 i +247,1069 Da u PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Ćelije koje stabilno eksprimiraju fuzionirani miniSOG gen su postavljene u posude od 6 cm.Nakon postizanja ~80% konfluencije, ćelije su jednom isprane sa HBSS (Gibco, #14025092), zatim inkubirane sa hemijskim sondama u HBSS 1 sat na 37°C i osvetljene plavim svetlom.10W LED 20 minuta na sobnoj temperaturi.Da bi se utvrdilo koja vrsta reaktivnih vrsta kiseonika je uključena u PDPL, 0,5 mM vitamina C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0) , 100 mM manitola (Energy Chemical, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 dodato je ćelijama kao suplementi.Nakon ispiranja sa hladnim PBS-om, ćelije su ostrugane, sakupljene u epruvete za centrifugiranje od 1,5 ml i ultrazvučno obrađene vrhom 1 min u 200 μl PBS-a sa 1x inhibitorom proteaze bez EDTA (1 s i 1 s bez, amplituda 35%).Rezultirajuća smjesa je centrifugirana na 15,871 × g 10 minuta na 4 °C i koncentracija supernatanta je podešena na 1 mg/mL korištenjem kompleta za analizu BCA proteina.Približno 50 µl gornjeg lizata je inkubirano sa 0,1 mM rodamin azida (Aladdin, br. T131368), 1 mM TCEP, 0,1 mM TBTA liganda i 1 mM CuSO4 tokom 1 sata od donje do gornje temperature sa rotiranjem.Nakon klik reakcije, obavljeno je taloženje acetonom dodavanjem 250 μl prethodno ohlađenog acetona uzorcima, inkubiranjem na -20°C 20 minuta i centrifugiranjem na 6010×g 10 minuta na 4°C.Sakupite pelet i kuhajte u 50 µl 1x Laemmlijevog pufera 10 minuta na 95 °C.Uzorci su zatim analizirani na SDS-PAGE dugim gelovima i vizualizirani korištenjem Bio-rad ChemiDoc MP Touch sistema za snimanje sa softverom Image Lab Touch.
Ekspresija i pročišćavanje rekombinantnog miniSOG-6xHis proteina izvedeno je kao što je prethodno opisano.Ukratko, ćelije E. coli BL21(DE3) (TransGen, #CD701-02) su transformisane sa pET21a-miniSOG-6xHis i ekspresija proteina je indukovana sa 0,5 mM IPTG (Sangon, #A600168).Nakon ćelijske lize, proteini su pročišćeni korištenjem Ni-NTA agaroznih kuglica (MCE, br. 70666), dijalizirani protiv PBS-a i čuvani na –80°C.
Za in vitro test blizine oznaka na bazi antitijela, pomiješajte 100 μM pročišćenog miniSOG-a, 1 mM sonde 3 i 1 μg anti-label mišjeg monoklonskog antitijela (TransGen, #HT501-01) u PBS-u do ukupne zapremine reakcije od 50 μl..Reakciona smjesa je ozračena plavim LED svjetlom 0, 2, 5, 10 i 20 minuta na sobnoj temperaturi.Smjesa je inkubirana sa 0,1 mM biotin-PEG3-azida (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0,1 mM TBTA liganda i 1 mM CuSO4 tokom 1 h na sobnoj temperaturi na mućkalici s pokretom prema gore.Nakon brze reakcije, dodajte 4x Laemmlijev pufer direktno u smjesu i kuhajte na 95°C 10 min.Uzorci su analizirani na SDS-PAGE gelovima i analizirani Western blottingom sa streptavidinom-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068).
Sintetički peptid koji sadrži histidin sa C-terminalnom amidacijom (LHDALDAK-CONH2) korišten je za analizu in vitro obilježavanja na bazi peptida u blizini.U ovom testu, 100 μM pročišćenog miniSOG, 10 mM sonde 3 i 2 μg/ml sintetičkog peptida pomiješani su u PBS u ukupnoj reakcijskoj zapremini od 50 μl.Reakciona smeša je ozračena plavim LED svetlom 1 sat na sobnoj temperaturi.Jedan mikrolitar uzorka je analiziran pomoću LC-MS sistema (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight maseni spektrometar sa softverom za analizu spektra MassLynx).
HEK293T ćelije koje stabilno eksprimiraju miniSOG fuzioni gen zasijane su u posude od 10 cm za linije različite lokalizacije organela (Mito, ER, Nucleus) i posude od 15 cm za Parkin-miniSOG i BRD4-miniSOG linije.Nakon postizanja ~90% konfluencije, ćelije su jednom isprane sa HBSS, zatim inkubirane sa sondom 3 u HBSS 1 sat na 37°C i osvijetljene plavom LED diodom od 10 W na sobnoj temperaturi.Za beskontaktno obilježavanje Parkina, 10 µM proton karbonil cijanidnog nosača m-klorofenilhidrazona CCCP (Solarbio, #C6700) sa sondom 3 u HBSS je dodan 1 sat na 37°C.Liza ćelija, hemija klika, redukcija i koraci alkilacije bili su isti kao što je gore opisano, osim što je dodato 2 mg lizata i biotin PEG3 azid je korišten u klik reakciji umjesto fotorazgradivog biotin azida.Nakon obogaćivanja, kuglice su isprane 3 puta sa 5 ml PBS koji sadrži 0,2% SDS, 3 puta sa 5 ml PBS koji sadrži 1 M ureu i 3 puta sa 5 ml PBS.Nakon toga, 2 µg tripsina je dodato u 300 µl 25 mM ABC koji sadrži 1 M ureu da bi se protein cijepao preko noći na 37°C.Reakcija je zaustavljena dodavanjem mravlje kiseline dok se ne postigne pH od 2-3.Nakon tripsinizacije na kuglicama, rastvor peptida je odsoljen pomoću SOLAµ HRP kolone (Thermo, #60209-001) i osušen u Speedvac vakuum koncentratoru.Peptidi su ponovo rastvoreni u 0,1% mravlje kiseline i 500 ng peptida je analizirano korišćenjem Orbitrap Fusion Lumos Tribrid masenog spektrometra opremljenog nano-ESI izvorom opisanim gore.Peptidi su razdvojeni na komercijalnim RP-HPLC predkolonama (75 μm x 2 cm) (Thermo, br. 164946) i analitičkim RP-HPLC kolonama (75 μm x 25 cm) (Thermo, br. 164941), obe ispunjene sa 2 μm.gradijent od 8% do 35% ACN za 60 minuta, zatim linearno povećan na 98% B za 6 minuta pri brzini protoka od 300 Nl/min.MS spektri (350-1500 m/z) su sakupljeni sa rezolucijom od 60.000, AGC 4 × 105, i maksimalnim ulaznim vremenom od 50 ms.Odabrani ioni su sekvencijalno fragmentirani pomoću HCD-a u ciklusima od 3 s s normaliziranom energijom sudara od 30%, kvadrupolnim izolacijskim prozorom od 1,6 m/z i rezolucijom od 15000. AGC cilj tandem masenog spektrometra 5 × 104 i maksimalno vrijeme ubrizgavanja od 22 ms.Dinamičko izuzimanje je postavljeno na 45 sekundi. Nedodijeljeni joni ili oni sa nabojem od 1+ i >7+ odbijeni su za MS/MS. Nedodijeljeni joni ili oni sa nabojem od 1+ i >7+ odbijeni su za MS/MS. Neznačeni joni ili joni sa zaporkom 1+ i >7+ bili su otklonjeni za MS/MS. Nedodijeljeni joni ili joni sa nabojem od 1+ i >7+ su odbijeni za MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Neukazani joni ili joni sa zaradom 1+ i >7+ bili su otklonjeni za MS/MS. Nespecificirani joni ili joni sa nabojem od 1+ i >7+ su odbijeni za MS/MS.
Koraci pripreme uzorka do obogaćivanja zrna NeutrAvidina bili su isti kao u gore opisanoj LC-MS/MS analizi.Otprilike 50 μg lizata korišteno je kao ulaz za kontrolu opterećenja, a 2 mg lizata je korišteno za klik reakcije.Nakon obogaćivanja i ispiranja neutravidinom, vezani proteini su eluirani dodavanjem 50 μl Laemmlijevog pufera u kuglice agarozne smole i ključanjem na 95°C 5 minuta.Kontrolno opterećenje i uzorci obogaćeni zrncima analizirani su pomoću SDS-PAGE i prebačeni na PVDF membrane (Millipore, #ISEQ00010) standardnim Western blot metodama.Membrane su blokirane sa 5% obranog mleka (Sangon, #A600669) u TBS koji sadrži 0,1% tween-20 (TBST) i inkubirane su uzastopno sa primarnim i sekundarnim antitelima.Primarna antitijela su razrijeđena 1:1000 u 5% obranog mlijeka u TBST i inkubirana preko noći na 4°C.Sekundarna antitijela su korištena u omjeru 1:5000 i inkubirana 1 sat na sobnoj temperaturi.Membrane su vizualizirane hemiluminiscencijom korištenjem Chemidoc MP sistema za snimanje.Svi neobrezani skenovi mrlja i gelova na slici su predstavljeni kao neobrađeni podaci.
Primarna antitela korišćena u ovoj studiji uključivala su zečje anti-SFPQ monoklonsko antitelo (CST, br. 71992), zečje anti-FUS monoklonsko antitelo (CST, br. 67840), zečje anti-NSUN2 poliklonsko antitelo (Proteintech, br. 20854-1- AP), zečje anti-mSin3A poliklonsko antitijelo (Abcam, #ab3479), mišje anti-tag monoklonsko antitijelo (TransGen, #HT201-02), mišje anti-β-aktin monoklonsko antitijelo (TransGen, #HC201-01), zečje antitijelo -CDK2 monoklonsko antitijelo (ABclonal, #A0094), zečje monoklonsko antitijelo na CTBP1 (ABclonal, #A11600), zečje poliklonsko antitijelo na DUT (ABclonal, #A2901), zečje poliklonsko antitijelo na PSMC4 (AB2510), #A250 DNAJB1 poliklonsko antitelo (ABclonal, # A5504).Ova antitela su korišćena u razblaženju 1:1000 u 5% obranog mleka u TBST.Sekundarna antitijela korištena u ovoj studiji uključivala su anti-zečji IgG (TransGen, #HS101-01), anti-mišji IgG (TransGen, #HS201-01) u razrjeđenju 1:5000.
Da bi se dalje istražilo da li BRD4 stupa u interakciju sa SFPQ, stabilne ćelije HEK293T i BRD4-miniSOG koje prekomjerno eksprimiraju HEK293T stavljene su u posude od 10 cm.Ćelije su isprane hladnim PBS i lizirane u 1 ml Pierce IP pufera za lizu (Thermo Fisher, #87787) sa inhibitorom proteaze bez EDTA tokom 30 minuta na 4°C.Nakon toga, lizati su sakupljeni u epruvete za centrifugiranje od 1,5 ml i centrifugirani na 15,871 xg 10 minuta na 4°C.Supernatant je sakupljen i inkubiran sa 5 µg anti-V5 označenog mišjeg monoklonskog antitela (CST, #80076) preko noći na 4°C.Operite približno 50 µl proteinskih A/G magnetnih kuglica (MCE, #HY-K0202) dvaput sa PBS-om koji sadrži 0,5% Tween-20.Zatim su ćelijski lizati inkubirani sa magnetnim kuglicama 4 sata na 4°C uz rotaciju odozdo prema gore.Zatim su perle četiri puta isprane sa 1 ml PBST pufera i kuvane na 95°C 5 min.Uzorci su analizirani na SDS-PAGE gelovima i prebačeni na PVDF membrane koristeći standardne Western blot metode.Membrane su blokirane u 5% obranog mlijeka u TBST i inkubirane uzastopno s primarnim i sekundarnim antitijelima.Primarno antitijelo Zečje anti-SFPQ monoklonsko antitijelo (CST, #71992) korišteno je u omjeru od 1:1000 u 5% obranog mlijeka u TBST i inkubirano preko noći na 4°C.Anti-zečji IgG je korišten u omjeru 1:5000 i inkubiran 1 sat na sobnoj temperaturi.Membrane su vizualizirane hemiluminiscencijom korištenjem Chemidoc MP sistema za snimanje.
Sve strukture koje se koriste za analizu površine pristupačne rastvaraču (SASA) su dobijene iz Protein Data Bank (PDB)52 ili AlphaFold Protein Structure Database53.Apsolutni SASA je izračunat za svaki ostatak pomoću programa FreeSASA.Samo potpuni i nedvosmisleni SASA podaci za obilježeni histidin i njegove susjede korišteni su za dobivanje srednje vrijednosti SASA za svaku strukturu.Relativna dostupnost rastvarača (RSA) za svaki histidin izračunata je dijeljenjem apsolutne vrijednosti SASA sa empirijskom maksimalnom mogućom površinom ostatka koja je dostupna rastvaraču.Svi histidini su tada klasifikovani kao skriveni ako je srednja vrednost RSA bila ispod 20%, inače izloženi56.
Sirovi fajlovi dobijeni u DDA režimu su pretraženi pomoću Proteome Discoverer-a (v2.5) ili MSfragger-a (Fragpipe v15.0) u odgovarajućoj SwissProt verifikovanoj bazi proteina koja sadrži uobičajene kontaminante.Peptidi su zahtijevali potpuni tripsin sa dva nedostajuća mjesta cijepanja, karbamoil metilacijom kao fiksnom modifikacijom i oksidacijom metionina kao dinamičkom modifikacijom.Tolerancije težine prekursora i fragmenta su postavljene na 10 ppm i 0,02 Da (MS2 Orbitrap), respektivno. Pogoci zagađivača su uklonjeni, a proteini filtrirani da bi se dobila stopa lažnog otkrivanja od <1%. Pogoci zagađivača su uklonjeni, a proteini filtrirani da bi se dobila stopa lažnog otkrivanja od <1%. Popadajući zagrljajući materijali bili su uklonjeni, a belci su otfiltrovani, da bi dobili koeficijent ložnog otkrića <1%. Pogoci zagađivača su uklonjeni, a proteini filtrirani da bi se dobila stopa lažne detekcije od <1%.去除污染物命中,过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 Popadajući zagrljajući materijali bili su uklonjeni, a belci otfiltrovani za postizanje nivoa ložnih otkrivenih <1%. Pogoci zagađivača su uklonjeni, a proteini filtrirani da bi se postigla stopa lažnih pozitivnih rezultata od <1%.Za kvantitativnu analizu bez upotrebe oznaka korišten je normalizirani sadržaj proteina iz tri biološka ponavljanja.Analiza subcelularne lokalizacije proteina izvedena je pomoću analize genske ontologije (GO) iz DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 i baza podataka koje je sastavila i objavila grupa Alice Ting.Karta vulkana je dobijena od Perseja (v1.6.15.0). Promjene nabora u obilju proteina su testirane na statističku značajnost korištenjem dvostranog t-testa, a pogoci proteina su identificirani s promjenom obilja >2 (osim ako nije drugačije navedeno) i p vrijednošću <0,05. Promjene nabora u obilju proteina su testirane na statističku značajnost korištenjem dvostranog t-testa, a pogoci proteina su identificirani s promjenom obilja >2 (osim ako nije drugačije navedeno) i p vrijednošću <0,05. Izmjena kratnosti sadržaja beleka provjerena je na statističku značajnost s korištenjem dvostranog t-kriterijuma, i sovpadeni belekovi su identificirani s promjenom sadržaja> 2 (ako nije navedeno) i vrijednost p <0,05. Promjene nabora sadržaja proteina su testirane na statističku značajnost korištenjem dvostranog t-testa, a podudaranja proteina su identificirana sa promjenom sadržaja >2 (osim ako nije drugačije naznačeno) i ap vrijednošću <0,05.使用 双边 T 检验 测试 蛋白质 丰度 倍数 变化 的 统计 统计, 并 确定 蛋白质 命 命 中 的 丰度 变化> 2 (除非 另 有 说明) 和 p 值 <0,05.使用 双边 T 检验 测试 蛋白质 倍 数 变化 的 统计 显着性 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化> 2 (另 有 说明) 和 p 值 <0,05. Statistička značajnost kratkih izmjena sadržaja koji se provjerava pomoću dvostranog t-kriterijuma, a sovpadeni belkov određuje sadržaj izmjena >2 (ako nije navedeno) i p-značaja <0,05. Statistička značajnost nagomilanih promjena sadržaja proteina testirana je korištenjem dvostranog t-testa, a podudaranja proteina su određena za promjene sadržaja >2 (osim ako nije drugačije naznačeno) i p-vrijednosti <0,05.Analiza interakcije proteina izvedena je korištenjem GO analize zajedno sa String bazom podataka.
Provedene su tri biološke replike sa sličnim rezultatima.Statistička analiza je rađena sa GraphPad Prism (GraphPad softver), a grafikoni vulkana generisani su sa Perseusom (v1.6.15.0).Za poređenje dvije grupe, p-vrijednosti su određene pomoću dvostranog Studentovog t-testa.Samo singleton proteini identificirani najmanje dva puta u eksperimentalnoj grupi uključeni su u grafikone vulkana, a odgovarajuće nedostajuće vrijednosti u kontrolnoj grupi zamijenjene su Perseusom iz normalne distribucije kako bi se mogla izračunati p-vrijednost.Trake greške predstavljaju srednju vrijednost ± standardnu ​​devijaciju.U proteomskim analizama za statističku analizu, zadržano je obilje proteina koji su se pojavili u najmanje dvije biološke replike.Statističke metode nisu korištene za prethodno određivanje veličine uzorka.Eksperimenti nisu slučajni.Istraživači nisu bili slijepi za zadatke tokom eksperimenta i evaluacije rezultata.
Za više informacija o dizajnu studije, pogledajte sažetak Izvještaja o istraživanju prirode povezan s ovim člankom.
Podaci masene spektrometrije dobijeni u ovoj studiji dostavljeni su Konzorcijumu ProteomeXchange preko iProX57 partnerskog spremišta pod ID skupa podataka PXD034811 (PDPL-MS skup podataka).Sirovi podaci se pružaju u obliku datoteka sirovih podataka.Ovaj članak daje originalne podatke.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Upoznavanje susjedstva: korištenje biotinilacije zavisne od blizine za karakterizaciju proteinskih kompleksa i mapiranje organela. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Upoznavanje susjedstva: korištenje biotinilacije zavisne od blizine za karakterizaciju proteinskih kompleksa i mapiranje organela.Gingras, AS, Abe, KT i Raut, B. Poznavanje okoline: korištenje biotinilacije zavisne od blizine za karakterizaciju proteinskih kompleksa i mapiranje organela. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Razumijevanje susjedstva: koristite ovisnost susjedstva o biološkom životu.Gingras, AS, Abe, KT i Raut, B. Razumijevanje blizine: karakterizacija proteinskih kompleksa i mapiranje organela korištenjem biotinilacije zavisne od blizine.Current.Moje mišljenje.Hemijski.biologija 48, 44–54 (2019).
Geri, JB i dr.Mapiranje mikrookruženja prenošenjem Dexterove energije na imune ćelije.Science 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL et al.Mreže s dva proteoma otkrivaju ćelijsko specifično remodeliranje ljudskog interaktoma.Ćelije 184, 3022–3040.e3028 (2021).