Hvala vam što ste posjetili Nature.com.Verzija pretraživača koju koristite ima ograničenu podršku za CSS.Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažurirani pretraživač (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru).U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Učinkoviti fotosenzibilizatori su posebno važni za široku kliničku primjenu fototerapije.Međutim, konvencionalni fotosenzibilizatori generalno pate od apsorpcije kratke talasne dužine, nedovoljne fotostabilnosti, niskog kvantnog prinosa reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) i gašenja ROS izazvanog agregacijom.Ovdje izvještavamo o skoro infracrvenom (NIR) supramolekularnom fotosenzibilizatoru (RuDA) posredovanom samosastavljanjem Ru(II)-aren organometalnih kompleksa u vodenom rastvoru.RuDA može generirati singlet kisik (1O2) samo u agregiranom stanju, i pokazuje očigledno ponašanje generiranja 1O2 izazvano agregacijom zbog značajnog povećanja procesa ukrštanja između singlet-triplet sistema.Pod dejstvom laserske svetlosti od 808 nm, RuDA pokazuje kvantni prinos 1O2 od 16,4% (indocijaninsko zeleno odobreno od strane FDA: ΦΔ=0,2%) i visoku efikasnost fototermalne konverzije od 24,2% (komercijalne zlatne nanošipke) sa odličnom fotostabilnošću.: 21,0%, zlatne nanoljuske: 13,0%).Osim toga, RuDA-NP sa dobrom biokompatibilnošću mogu se prvenstveno akumulirati na tumorskim mjestima, uzrokujući značajnu regresiju tumora tokom fotodinamičke terapije sa smanjenjem volumena tumora od 95,2% in vivo.Ova fotodinamička terapija koja povećava agregaciju pruža strategiju za razvoj fotosenzibilizatora sa povoljnim fotofizičkim i fotohemijskim svojstvima.
U poređenju sa konvencionalnom terapijom, fotodinamička terapija (PDT) je atraktivan tretman za rak zbog svojih značajnih prednosti kao što su precizna prostorno-temporalna kontrola, neinvazivnost, zanemarljiva rezistencija na lijekove i minimiziranje nuspojava 1,2,3.Pod svjetlosnim zračenjem, fotosenzibilizatori koji se koriste mogu se aktivirati da formiraju visoko reaktivne kisikove vrste (ROS), što dovodi do apoptoze/nekroze ili imunoloških odgovora4,5. Međutim, većina konvencionalnih fotosenzibilizatora, kao što su hlorini, porfirini i antrakinoni, imaju relativno kratkotalasnu apsorpciju (frekvencija < 680 nm), što dovodi do lošeg prodora svjetlosti zbog intenzivne apsorpcije bioloških molekula (npr. hemoglobina i melanina) vidljiva regija6,7. Međutim, većina konvencionalnih fotosenzibilizatora, kao što su hlorini, porfirini i antrakinoni, imaju relativno kratkotalasnu apsorpciju (frekvencija < 680 nm), što dovodi do lošeg prodora svjetlosti zbog intenzivne apsorpcije bioloških molekula (npr. hemoglobina i melanina) vidljiva regija6,7. Međutim, većina običnih fotosensibilizatora, poput klorina, porfirina i antrahinona, imaju relativno kratkovolnovno pogloćanje (dio < 680 nm), što dovodi do lošeg prodora svijeta zbog intenzivnog poglošenja bioloških molekula (na primjer, gemoglobina i melanina) u vidljivoj oblasti6,7. Međutim, najčešći fotosenzibilizatori kao što su hlorini, porfirini i antrakinoni imaju apsorpciju relativno kratke talasne dužine (< 680 nm) što dovodi do lošeg prodora svetlosti usled intenzivne apsorpcije bioloških molekula (npr. hemoglobina i melanina) u vidljivo područje6,7.然而, 大多数 传统 的 光敏剂, 如 二 氢 卟酚, 卟啉 和 蒽醌, 具有 相对 较 短 的 波长 吸收 (频率 <680 nm), 因此 由于 对 生物 分子 (如 血红 蛋白 和 黑色素) 的 强烈 吸收,导致光穿透性差。然而, 大多数 传统 的 光敏剂, 二 氢 卟酚, 卟啉 蒽醌, 具有 相对 较 短 的 波长 吸收 (频率 频率 <680 nm) 因此 由于 对 分子 (血红 蛋白 和 黑色素) 的 ,,,, 吸收 吸收 吸收吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 HI导致光穿透性差。 Međutim, većina tradicionalnih fotosenzibilizatora, poput klorina, porfirina i antrahinona, imaju relativno kratkovolnovo pogloćanje (dio < 680 nm) zbog jakog pogloštanja biomolekula, kao što su gemoglobin i melan, što dovodi do lošeg prodora svijeta. Međutim, većina tradicionalnih fotosenzibilizatora kao što su hlorini, porfirini i antrakinoni imaju apsorpciju relativno kratke talasne dužine (frekvencija < 680 nm) zbog jake apsorpcije biomolekula kao što su hemoglobin i melanin što rezultira lošim prodiranjem svetlosti.Vidljivo područje 6.7.Stoga su fotosenzibilizatori koji apsorbiraju bliski infracrveni (NIR) koji se aktiviraju u „terapijskom prozoru“ od 700–900 nm vrlo pogodni za fototerapiju.Budući da biološka tkiva najmanje apsorbiraju blisku infracrvenu svjetlost, to može dovesti do dublje penetracije i manjeg fotooštećenja8,9.
Nažalost, postojeći fotosenzibilizatori koji apsorbiraju NIR općenito imaju lošu fotostabilnost, nizak kapacitet stvaranja singletnog kisika (1O2) i gašenje 1O2 izazvano agregacijom, što ograničava njihovu kliničku primjenu10,11.Iako su uloženi veliki napori da se poboljšaju fotofizička i fotohemijska svojstva konvencionalnih fotosenzibilizatora, do sada je nekoliko izvještaja objavilo da fotosenzibilizatori koji apsorbiraju NIR mogu riješiti sve ove probleme.Pored toga, nekoliko fotosenzibilizatora pokazalo je obećanje za efikasno stvaranje 1O212,13,14 kada su ozračeni svjetlošću iznad 800 nm, budući da energija fotona brzo opada u bliskom IR području.Trifenilamin (TFA) kao donor elektrona i [1,2,5]tiadiazol-[3,4-i]dipirido[a,c]fenazin (TDP) kao grupa akceptora elektrona Donorsko-akceptorski (DA) tip bojila klasu boja, koje apsorbiraju blisku infracrvenu vezu, koje su opsežno proučavane za bioimaging II bliske infracrvene svjetlosti i fototermalnu terapiju (PTT) zbog njihovog uskog pojasa.Dakle, boje DA tipa mogu se koristiti za PDT sa ekscitacijom blizu IR, iako su rijetko proučavane kao fotosenzibilizatori za PDT.
Dobro je poznato da visoka efikasnost međusistemskog ukrštanja (ISC) fotosenzibilizatora podstiče stvaranje 1O2.Uobičajena strategija za unapređenje ISC procesa je poboljšanje spin-orbitnog spajanja (SOC) fotosenzibilizatora uvođenjem teških atoma ili posebnih organskih dijelova.Međutim, ovaj pristup još uvijek ima neke nedostatke i ograničenja19,20.Nedavno je supramolekularno samosastavljanje pružilo inteligentni pristup odozdo prema gore za proizvodnju funkcionalnih materijala na molekularnom nivou,21,22 sa brojnim prednostima u fototerapiji: (1) fotosenzibilizatori koji se sami sastavljaju mogu imati potencijal da formiraju trakaste strukture.Slično elektronskim strukturama sa gustijom distribucijom nivoa energije zbog preklapanja orbita između građevnih blokova.Stoga će se poboljšati energetsko podudaranje između donjeg singletnog pobuđenog stanja (S1) i susjednog tripletnog pobuđenog stanja (Tn), što je korisno za ISC proces 23, 24 .(2) Supramolekularni sklop će smanjiti neradijativnu relaksaciju zasnovanu na mehanizmu ograničenja intramolekularnog kretanja (RIM), koji također promovira ISC proces 25, 26 .(3) Supramolekularni sklop može zaštititi unutrašnje molekule monomera od oksidacije i degradacije, čime se značajno poboljšava fotostabilnost fotosenzibilizatora.S obzirom na gore navedene prednosti, vjerujemo da supramolekularni fotosenzibilizatorski sistemi mogu biti obećavajuća alternativa za prevazilaženje nedostataka PDT-a.
Kompleksi na bazi Ru(II) su obećavajuća medicinska platforma za potencijalnu primjenu u dijagnostici i terapiji bolesti zbog svojih jedinstvenih i atraktivnih bioloških svojstava28,29,30,31,32,33,34.Osim toga, obilje pobuđenih stanja i podesiva fotofizičko-hemijska svojstva kompleksa na bazi Ru(II) pružaju velike prednosti za razvoj fotosenzibilizatora na bazi Ru(II)35,36,37,38,39,40.Značajan primjer je rutenijum(II) polipiridil kompleks TLD-1433, koji je trenutno u fazi II kliničkih ispitivanja kao fotosenzibilizator za liječenje nemišićno invazivnog karcinoma mokraćne bešike (NMIBC)41.Pored toga, rutenijum(II)aren organometalni kompleksi se široko koriste kao hemoterapeutski agensi za lečenje raka zbog svoje niske toksičnosti i lakoće modifikacije42,43,44,45.Jonska svojstva Ru(II)-aren organometalnih kompleksa ne samo da mogu poboljšati lošu rastvorljivost DA hromofora u uobičajenim rastvaračima, već i da poboljšaju sklapanje DA hromofora.Osim toga, pseudooktaedarska polu-sendvič struktura organometalnih kompleksa Ru(II)-arena može sterički spriječiti H-agregaciju hromofora tipa DA, čime se olakšava formiranje J-agregacije sa crvenim pomacima apsorpcionih traka.Međutim, inherentni nedostaci Ru(II)-aren kompleksa, kao što su niska stabilnost i/ili loša biodostupnost, mogu uticati na terapijsku efikasnost i in vivo aktivnost kompleksa aren-Ru(II).Međutim, studije su pokazale da se ovi nedostaci mogu prevazići inkapsuliranjem kompleksa rutenijuma sa biokompatibilnim polimerima fizičkom enkapsulacijom ili kovalentnom konjugacijom.
U ovom radu izvještavamo o DA-konjugovanim kompleksima Ru(II)-arena (RuDA) sa NIR okidačem preko koordinacione veze između DAD hromofora i Ru(II)-arenskog dela.Rezultirajući kompleksi mogu se samosastaviti u metalosupramolekularne vezikule u vodi zbog nekovalentnih interakcija.Značajno, supramolekularni sklop je dao RuDA svojstvima intersistemskog crossingover-a izazvanog polimerizacijom, što je značajno povećalo efikasnost ISC, što je bilo vrlo povoljno za PDT (slika 1A).Da bi se povećala akumulacija tumora i in vivo biokompatibilnost, Pluronic F127 (PEO-PPO-PEO) odobren od strane FDA korišten je za inkapsulaciju RuDA47,48,49 za stvaranje nanočestica RuDA-NP (Slika 1B) koje su djelovale kao visoko efikasan PDT/Dual- način PTT proxy .U fototerapiji raka (Slika 1C), RuDA-NP je korišten za liječenje golih miševa sa MDA-MB-231 tumorima kako bi se proučavala efikasnost PDT i PTT in vivo.
Šematska ilustracija fotofizičkog mehanizma RuDA u monomernim i agregiranim oblicima za fototerapiju raka, sintezu B RuDA-NP i C RuDA-NP za NIR-aktivirani PDT i PTT.
RuDA, koji se sastoji od TPA i TDP funkcionalnosti, pripremljen je prema proceduri prikazanoj na Dodatnoj slici 1 (Slika 2A), a RuDA je okarakterisan 1H i 13C NMR spektrima, elektrosprej jonizacionom masenom spektrometrijom i elementarnom analizom (dodatne slike 2-4 ).RuDA mapa razlike elektronske gustoće najnižeg singletnog prijelaza izračunata je teorijom funkcionalne gustine ovisno o vremenu (TD-DFT) radi proučavanja procesa prijenosa naboja.Kao što je prikazano na dodatnoj slici 5, gustoća elektrona uglavnom se kreće od trifenilamina do TDP akceptorske jedinice nakon fotoekscitacije, što se može pripisati tipičnoj tranziciji unutarmolekulskog prijenosa naboja (CT).
Hemijska struktura rude B Spektri apsorpcije rude u mješavinama različitih omjera DMF i vode.C Normalizovane vrednosti apsorpcije RuDA (800 nm) i ICG (779 nm) u odnosu na vreme pri 0,5 W cm-2 laserskog svetla od 808 nm.D Na fotodegradaciju ABDA ukazuje stvaranje 1O2 izazvano RuDA u mješavinama DMF/H2O s različitim sadržajem vode pod djelovanjem laserskog zračenja talasne dužine 808 nm i snage 0,5 W/cm2.
Sažetak—UV-vidljiva apsorpciona spektroskopija je korištena za proučavanje svojstava samosastavljanja rude u mješavinama DMF-a i vode u različitim omjerima.Kao što je prikazano na sl.2B, RuDA pokazuje apsorpcione trake od 600 do 900 nm u DMF-u sa maksimalnom apsorpcionom trakom na 729 nm.Povećanje količine vode dovelo je do postepenog crvenog pomaka maksimuma apsorpcije rude na 800 nm, što ukazuje na J-agregaciju rude u sastavljenom sistemu.Spektri fotoluminiscencije RuDA u različitim rastvaračima prikazani su na dodatnoj slici 6. Čini se da RuDA pokazuje tipičnu NIR-II luminiscenciju s maksimalnom talasnom dužinom emisije od ca.1050 nm u CH2Cl2 i CH3OH, respektivno.Veliki Stokesov pomak (oko 300 nm) RuDA ukazuje na značajnu promjenu u geometriji pobuđenog stanja i formiranje niskoenergetskih pobuđenih stanja.Kvantni prinosi luminiscencije rude u CH2Cl2 i CH3OH su 3,3 odnosno 0,6%.Međutim, u mješavini metanola i vode (5/95, v/v) uočen je blagi crveni pomak emisije i smanjenje kvantnog prinosa (0,22%), što može biti posljedica samosastavljanja rude. .
Da bismo vizualizirali samosastavljanje ORE, koristili smo mikroskopiju tečne atomske sile (AFM) za vizualizaciju morfoloških promjena u ORE u otopini metanola nakon dodavanja vode.Kada je sadržaj vode bio ispod 80%, nije uočeno jasno agregiranje (dopunska slika 7).Međutim, daljim povećanjem sadržaja vode na 90–95%, pojavile su se male nanočestice, što je ukazivalo na samosastavljanje rude. Osim toga, lasersko zračenje talasne dužine od 808 nm nije uticalo na intenzitet apsorpcije RuDA u vodenom rješenje (slika 2C i dopunska slika 8).Nasuprot tome, apsorbancija indocijaninskog zelenog (ICG kao kontrola) je brzo opala na 779 nm, što ukazuje na odličnu fotostabilnost RuDA.Dodatno, stabilnost RuDA-NP u PBS (pH = 5,4, 7,4 i 9,0), 10% FBS i DMEM (visoka glukoza) ispitana je UV-vidljivom apsorpcionom spektroskopijom u različitim vremenima.Kao što je prikazano na Dodatnoj slici 9, blage promjene u RuDA-NP apsorpcionim trakama su uočene u PBS pri pH 7,4/9,0, FBS i DMEM, što ukazuje na odličnu stabilnost RuDA-NP.Međutim, u kiseloj sredini (rN = 5,4) pronađena je hidroliza rude.Također smo dodatno procijenili stabilnost RuDA i RuDA-NP koristeći metode tečne hromatografije visokih performansi (HPLC).Kao što je prikazano na Dodatnoj slici 10, RuDA je bio stabilan u mješavini metanola i vode (50/50, v/v) tokom prvog sata, a hidroliza je uočena nakon 4 sata.Međutim, uočen je samo široki konkavno-konveksni vrh za RuDA NP.Stoga je gel permeacijska hromatografija (GPC) korištena za procjenu stabilnosti RuDA NP u PBS (pH = 7,4).Kao što je prikazano na Dodatnoj slici 11, nakon 8 sati inkubacije u testiranim uvjetima, visina vrha, širina vrha i površina vrha NP RuDA nisu se značajno promijenile, što ukazuje na odličnu stabilnost NP RuDA.Osim toga, TEM slike su pokazale da je morfologija RuDA-NP nanočestica ostala gotovo nepromijenjena nakon 24 sata u razrijeđenom PBS puferu (pH = 7,4, dodatna slika 12).
Budući da samosastavljanje može dati različite funkcionalne i hemijske karakteristike rude, uočili smo oslobađanje 9,10-antracendiilbis(metilen)dimalonske kiseline (ABDA, indikator 1O2) u mješavinama metanola i vode.Ruda sa različitim sadržajem vode50.Kao što je prikazano na slici 2D i dodatnoj slici 13, nije uočena degradacija ABDA kada je sadržaj vode bio ispod 20%.Sa povećanjem vlažnosti na 40%, došlo je do degradacije ABDA, o čemu svjedoči smanjenje intenziteta ABDA fluorescencije.Također je uočeno da veći sadržaj vode rezultira bržom degradacijom, što sugerira da je samosastavljanje RuDA neophodno i korisno za degradaciju ABDA.Ovaj fenomen se veoma razlikuje od modernih ACQ (gašenje izazvano agregacijom) hromofora.Kada se ozrači laserom talasne dužine od 808 nm, kvantni prinos 1O2 RuDA u mešavini 98% H2O/2% DMF iznosi 16,4%, što je 82 puta više od ICG (ΦΔ = 0,2%)51, pokazujući izuzetnu efikasnost proizvodnje 1O2 RuDA u agregiranom stanju.
Elektronski spinovi koristeći 2,2,6,6-tetrametil-4-piperidinon (TEMP) i 5,5-dimetil-1-pirolin N-oksid (DMPO) kao spin zamke Rezonantna spektroskopija (ESR) je korištena za identifikaciju rezultirajućih vrsta AFK.by RuDA.Kao što je prikazano na dodatnoj slici 14, potvrđeno je da se 1O2 stvara u vremenima ozračivanja između 0 i 4 minute.Pored toga, kada je RuDA inkubiran sa DMPO pod zračenjem, detektovan je tipičan četvororedni EPR signal od 1:2:2:1 DMPO-OH· adukta, što ukazuje na formiranje hidroksilnih radikala (OH·).Sve u svemu, gornji rezultati pokazuju sposobnost RuDA da stimuliše proizvodnju ROS kroz dvostruki tip I/II procesa fotosenzibilizacije.
Da bi se bolje razumjela elektronska svojstva RuDA u monomernim i agregiranim oblicima, granične molekularne orbitale RuDA u monomernim i dimernim oblicima izračunate su korištenjem DFT metode.Kao što je prikazano na sl.3A, najviša zauzeta molekularna orbitala (HOMO) monomernog RuDA je delokalizovana duž kičme liganda, a najniža nezauzeta molekularna orbitala (LUMO) je centrirana na TDP akceptorskoj jedinici.Naprotiv, gustoća elektrona u dimernom HOMO koncentrirana je na ligand jednog RuDA molekula, dok je elektronska gustoća u LUMO uglavnom koncentrisana na akceptorskoj jedinici drugog RuDA molekula, što ukazuje da je RuDA u dimeru.Karakteristike CT.
A HOMO i LUMO rude se izračunavaju u monomernim i dimernim oblicima.B Singletni i tripletni energetski nivoi Rude u monomerima i dimerima.C Procijenjeni nivoi RuDA i mogućih ISC kanala kao monomernog C i dimernog D. Strelice pokazuju moguće ISC kanale.
Raspodjela elektrona i rupa u niskoenergetskim singletnim pobuđenim stanjima RuDA u monomernom i dimernom obliku analizirana je pomoću softvera Multiwfn 3.852.53, koji su izračunati primjenom TD-DFT metode.Kao što je naznačeno na dodatnoj etiketi.Kao što je prikazano na slikama 1-2, monomerne RDA rupe su uglavnom delokalizovane duž kičme liganda u ovim singlet pobuđenim stanjima, dok su elektroni uglavnom locirani u TDP grupi, pokazujući intramolekularne karakteristike CT.Osim toga, za ova singlet pobuđena stanja, postoji manje ili više preklapanja između rupa i elektrona, što sugerira da ova singlet pobuđena stanja daju određeni doprinos lokalnoj ekscitaciji (LE).Za dimere, pored intramolekularnih CT i LE karakteristika, uočen je određeni udio intermolekularnih CT karakteristika u odgovarajućim stanjima, posebno S3, S4, S7 i S8, na osnovu intermolekularne CT analize, sa CT intermolekularnim prijelazima kao glavnim (Dopunska tabela).3).
Da bismo bolje razumjeli eksperimentalne rezultate, dodatno smo istražili svojstva pobuđenih stanja RuDA kako bismo istražili razlike između monomera i dimera (dodatne tabele 4-5).Kao što je prikazano na slici 3B, energetski nivoi singlet i triplet pobuđenih stanja dimera su mnogo gušći od onih monomera, što pomaže da se smanji energetski jaz između S1 i Tn. Prijavljeno je da se ISC prijelazi mogu realizirati unutar malog energetskog jaza (ΔES1-Tn < 0,3 eV) između S1 i Tn54. Prijavljeno je da se ISC prijelazi mogu realizirati unutar malog energetskog jaza (ΔES1-Tn < 0,3 eV) između S1 i Tn54. Za sada, da se prijelaz ISC može realizirati u granicama male energetske stanice (ΔES1-Tn <0,3 eV) između S1 i Tn54. Prijavljeno je da se ISC tranzicije mogu realizovati unutar malog energetskog jaza (ΔES1-Tn <0,3 eV) između S1 i Tn54.据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙 (ΔES1-Tn < 0,3 eV) 内实现。据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙 (ΔES1-Tn < 0,3 eV) 内实现。 Za sada je došlo do toga da se prelaz ISC može realizovati u malim granicama energije (ΔES1-Tn < 0,3 eV) između S1 i Tn54. Prijavljeno je da se ISC prijelaz može realizirati unutar malog energetskog jaza (ΔES1-Tn < 0,3 eV) između S1 i Tn54.Osim toga, samo jedna orbitala, zauzeta ili nezauzeta, mora se razlikovati u vezanim singletnim i tripletnim stanjima da bi se obezbijedio SOC integral različit od nule.Dakle, na osnovu analize energije pobude i orbitalne tranzicije, svi mogući kanali ISC tranzicije su prikazani na sl.3C,D.Značajno je da je samo jedan ISC kanal dostupan u monomeru, dok dimerni oblik ima četiri ISC kanala koji mogu poboljšati ISC tranziciju.Stoga je razumno pretpostaviti da što se više molekula RuDA agregira, to će ISC kanali biti pristupačniji.Stoga, RuDA agregati mogu formirati dvopojasne elektronske strukture u singletnom i tripletnom stanju, smanjujući energetski jaz između S1 i raspoloživog Tn, čime se povećava efikasnost ISC-a kako bi se olakšalo stvaranje 1O2.
Da bismo dalje razjasnili osnovni mehanizam, sintetizirali smo referentno jedinjenje kompleksa aren-Ru(II) (RuET) zamjenom dvije etil grupe s dvije trifenilamin fenil grupe u RuDA (slika 4A, za potpunu karakterizaciju, vidi ESI, Dodatni 15 -21 ) Od donora (dietilamin) do akceptora (TDF), RuET ima iste intramolekularne CT karakteristike kao RuDA.Kao što se i očekivalo, spektar apsorpcije RuET-a u DMF-u pokazao je nizak opseg prijenosa energije sa jakom apsorpcijom u bliskom infracrvenom području u području od 600-1100 nm (slika 4B).Osim toga, agregacija RuET-a je također uočena s povećanjem sadržaja vode, što se odrazilo na crveni pomak maksimuma apsorpcije, što je dodatno potvrđeno tečnim AFM snimanjem (dopunska slika 22).Rezultati pokazuju da RuET, kao i RuDA, može formirati intramolekularna stanja i samosastavljati se u agregirane strukture.
Hemijska struktura RuET-a.B Spektri apsorpcije RuET-a u mješavinama različitih omjera DMF-a i vode.Zemljišta C EIS Nyquist za RuDA i RuET.Fotostrujni odgovori D RuDA i RuET pod dejstvom laserskog zračenja talasne dužine 808 nm.
Fotodegradacija ABDA u prisustvu RuET-a procenjena je zračenjem laserom talasne dužine od 808 nm.Iznenađujuće, nije uočena degradacija ABDA u različitim frakcijama vode (dopunska slika 23).Mogući razlog je taj što RuET ne može efikasno da formira trakastu elektronsku strukturu jer etilni lanac ne promoviše efikasan intermolekularni prenos naelektrisanja.Zbog toga su izvršena elektrohemijska impedansna spektroskopija (EIS) i mjerenja prolazne fotostruje kako bi se uporedile fotoelektrokemijske osobine RuDA i RuET-a.Prema Nyquistovoj dijagramu (slika 4C), RuDA pokazuje mnogo manji radijus od RuET-a, što znači da RuDA56 ima brži intermolekularni transport elektrona i bolju provodljivost.Osim toga, gustina fotostruje RuDA je mnogo veća od one u RuET-u (slika 4D), što potvrđuje bolju efikasnost prijenosa naboja RuDA57.Dakle, fenil grupa trifenilamina u rudi igra važnu ulogu u obezbjeđivanju intermolekularnog prijenosa naboja i formiranja trakaste elektronske strukture.
Da bismo povećali akumulaciju tumora i in vivo biokompatibilnost, dodatno smo inkapsulirali RuDA sa F127.Prosječni hidrodinamički promjer RuDA-NP je određen na 123,1 nm sa uskom distribucijom (PDI = 0,089) korištenjem metode dinamičkog raspršenja svjetlosti (DLS) (Slika 5A), koja je promovirala akumulaciju tumora povećanjem permeabilnosti i zadržavanja.EPR) efekat.TEM slike su pokazale da NP rude imaju uniforman sferni oblik sa prosječnim prečnikom od 86 nm.Primjetno, maksimum apsorpcije RuDA-NP-a pojavio se na 800 nm (dopunska slika 24), što ukazuje da RuDA-NP-ovi mogu zadržati funkcije i svojstva samo-sastavljajućih RuDA-a.Izračunati kvantni prinos ROS za NP rudu je 15,9%, što je uporedivo sa rudom. Fototermalna svojstva RuDA NP su proučavana pod dejstvom laserskog zračenja talasne dužine 808 nm pomoću infracrvene kamere.Kao što je prikazano na sl.5B,C, kontrolna grupa (samo PBS) imala je blagi porast temperature, dok je temperatura rastvora RuDA-NPs brzo rasla sa povećanjem temperature (ΔT) na 15,5, 26,1 i 43,0°C.Visoke koncentracije su bile 25, 50 i 100 µM, respektivno, što ukazuje na snažan fototermalni efekat RuDA NP.Osim toga, mjerenja ciklusa grijanja/hlađenja su izvršena kako bi se ocijenila fototermalna stabilnost RuDA-NP i uporedila sa ICG.Temperatura NP rude se nije smanjila nakon pet ciklusa grijanja/hlađenja (slika 5D), što ukazuje na odličnu fototermalnu stabilnost rudnih NP-a.Nasuprot tome, ICG pokazuje nižu fototermalnu stabilnost kao što se vidi iz očiglednog nestanka fototermalnog temperaturnog platoa pod istim uslovima.Prema prethodnoj metodi58, efikasnost fototermalne konverzije (PCE) RuDA-NP izračunata je sa 24,2%, što je više od postojećih fototermalnih materijala kao što su nanošipke zlata (21,0%) i zlatne nanoljuske (13,0%)59.Dakle, NP rude pokazuju odlična fototermalna svojstva, što ih čini obećavajućim PTT agensima.
Analiza DLS i TEM slika RuDA NP (umetnuti).B Termičke slike različitih koncentracija RuDA NP izloženih laserskom zračenju na talasnoj dužini od 808 nm (0,5 W cm-2).C Krivulje fototermalne konverzije različitih koncentracija rudnih NP, koje su kvantitativni podaci.B. D Porast temperature ORE NP i ICG tokom 5 ciklusa grijanja-hlađenja.
Fotocitotoksičnost RuDA NP protiv MDA-MB-231 ljudskih ćelija raka dojke procijenjena je in vitro.Kao što je prikazano na sl.6A, B, RuDA-NP i RuDA su pokazali zanemarivu citotoksičnost u odsustvu zračenja, što implicira nižu tamnu toksičnost RuDA-NP i RuDA.Međutim, nakon izlaganja laserskom zračenju na talasnoj dužini od 808 nm, RuDA i RuDA NPs pokazali su snažnu fotocitotoksičnost protiv ćelija raka MDA-MB-231 sa vrednostima IC50 (pola maksimalne inhibitorne koncentracije) od 5,4 odnosno 9,4 μM, što pokazuje da RuDA-NP i RuDA imaju potencijal za fototerapiju raka.Osim toga, fotocitotoksičnost RuDA-NP i RuDA dodatno je istražena u prisustvu vitamina C (Vc), čistača ROS, kako bi se razjasnila uloga ROS u citotoksičnosti izazvanoj svjetlom.Očigledno je da se vitalnost stanica povećala nakon dodavanja Vc, a IC50 vrijednosti RuDA i RuDA NP bile su 25,7 i 40,0 μM, respektivno, što dokazuje važnu ulogu ROS u fotocitotoksičnosti RuDA i RuDA NP.Citotoksičnost RuDA-NP i RuDA izazvana svjetlom u ćelijama raka MDA-MB-231 bojenjem živih/mrtvih stanica korištenjem kalceina AM (zelena fluorescencija za žive ćelije) i propidijum jodida (PI, crvena fluorescencija za mrtve ćelije).potvrđeno ćelijama) kao fluorescentne sonde.Kao što je prikazano na slici 6C, ćelije tretirane sa RuDA-NP ili RuDA ostale su održive bez zračenja, o čemu svjedoči intenzivna zelena fluorescencija.Naprotiv, pod laserskim zračenjem uočena je samo crvena fluorescencija, što potvrđuje efektivnu fotocitotoksičnost RuDA ili RuDA NP.Važno je napomenuti da se nakon dodavanja Vc pojavila zelena fluorescencija, što ukazuje na kršenje fotocitotoksičnosti RuDA i RuDA NP.Ovi rezultati su u skladu sa in vitro testovima fotocitotoksičnosti.
Vijabilnost A RuDA- i B RuDA-NP ćelija u MDA-MB-231 ćelijama u prisustvu ili odsustvu Vc (0,5 mM), respektivno.Trake greške, srednja vrijednost ± standardna devijacija (n = 3). Neupareni, dvostrani t testovi *p < 0,05, **p < 0,01 i ***p < 0,001. Neupareni, dvostrani t testovi *p < 0,05, **p < 0,01 i ***p < 0,001. Neparnye dvustoronnie t-kriterije *p <0,05, **p <0,01 i ***p <0,001. Neupareni dvostrani t-testovi *p<0,05, **p<0,01 i ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。 Neparnye dvustoronnie t-testovi *p <0,05, **p <0,01 i ***p <0,001. Neupareni dvostrani t-testovi *p<0,05, **p<0,01 i ***p<0,001.C Analiza bojenja živih/mrtvih ćelija koristeći kalcein AM i propidijum jodid kao fluorescentne sonde.Skala bar: 30 µm.Prikazane su reprezentativne slike tri biološka ponavljanja iz svake grupe.D Konfokalne fluorescentne slike proizvodnje ROS-a u MDA-MB-231 ćelijama pod različitim uslovima tretmana.Zelena DCF fluorescencija ukazuje na prisustvo ROS.Zračiti laserom talasne dužine 808 nm snage 0,5 W/cm2 u trajanju od 10 minuta (300 J/cm2).Skala bar: 30 µm.Prikazane su reprezentativne slike tri biološka ponavljanja iz svake grupe.E Protočna citometrija RuDA-NPs (50 µM) ili RuDA (50 µM) analiza tretmana sa ili bez lasera od 808 nm (0,5 W cm-2) u prisustvu i odsustvu Vc (0,5 mM) tokom 10 min.Prikazane su reprezentativne slike tri biološka ponavljanja iz svake grupe.F Nrf-2, HSP70 i HO-1 ćelija MDA-MB-231 tretiranih RuDA-NPs (50 µM) sa ili bez laserskog zračenja od 808 nm (0,5 W cm-2, 10 min, 300 J cm-2), ćelije izražavaju 2).Prikazane su reprezentativne slike dva biološka ponavljanja iz svake grupe.
Intracelularna proizvodnja ROS-a u ćelijama MDA-MB-231 ispitana je metodom bojenja 2,7-dihlorodihidrofluorescein diacetatom (DCFH-DA).Kao što je prikazano na sl.6D, ćelije tretirane RuDA-NPs ili RuDA pokazale su izrazitu zelenu fluorescenciju kada su ozračene laserom od 808 nm, što ukazuje da RuDA-NP i RuDA imaju efikasnu sposobnost stvaranja ROS.Naprotiv, u odsustvu svjetlosti ili u prisustvu Vc, uočen je samo slab fluorescentni signal ćelija, što ukazuje na blago formiranje ROS.Intracelularni nivoi ROS-a u RuDA-NP ćelijama i RuDA-tretiranim MDA-MB-231 ćelijama dalje su određeni protočnom citometrijom.Kao što je prikazano na Dodatnoj slici 25, srednji intenzitet fluorescencije (MFI) generiran od strane RuDA-NP i RuDA pod laserskim zračenjem od 808 nm značajno je povećan za oko 5,1 odnosno 4,8 puta, u poređenju sa kontrolnom grupom, potvrđujući njihovo odlično formiranje AFK.kapacitet.Međutim, intracelularni nivoi ROS u RuDA-NP ili MDA-MB-231 ćelijama tretiranim RuDA bili su uporedivi samo sa kontrolama bez laserskog zračenja ili u prisustvu Vc, slično rezultatima analize konfokalne fluorescencije.
Pokazalo se da su mitohondrije glavna meta Ru(II)-aren kompleksa60.Stoga je istražena subcelularna lokalizacija RuDA i RuDA-NP.Kao što je prikazano na Dodatnoj slici 26, RuDA i RuDA-NP pokazuju slične profile ćelijske distribucije sa najvećom akumulacijom u mitohondrijima (62,5 ± 4,3 i 60,4 ± 3,6 ng/mg proteina, respektivno).Međutim, samo je mala količina Ru pronađena u nuklearnim frakcijama rude i NP rude (3,5 odnosno 2,1%).Preostala ćelijska frakcija je sadržavala rezidualni rutenijum: 31,7% (30,6 ± 3,4 ng/mg proteina) za RuDA i 42,9% (47,2 ± 4,5 ng/mg proteina) za RuDA-NP.Općenito, ruda i NP ruda se uglavnom akumuliraju u mitohondrijima.Da bismo procijenili mitohondrijalnu disfunkciju, koristili smo JC-1 i MitoSOX Red bojenje za procjenu potencijala mitohondrijalne membrane i kapaciteta proizvodnje superoksida, respektivno.Kao što je prikazano na Dodatnoj slici 27, intenzivna zelena (JC-1) i crvena (MitoSOX Red) fluorescencija je uočena u ćelijama tretiranim i RuDA i RuDA-NP pod laserskim zračenjem od 808 nm, što ukazuje da i RuDA i RuDA-NP visoko fluorescentne Može efikasno inducirati depolarizaciju mitohondrijske membrane i proizvodnju superoksida.Dodatno, mehanizam smrti ćelije određen je analizom aneksina V-FITC/propidijum jodida (PI) zasnovanom na protočnoj citometriji.Kao što je prikazano na slici 6E, kada su ozračeni laserom od 808 nm, RuDA i RuDA-NP izazvali su značajno povećanu ranu stopu apoptoze (donji desni kvadrant) u MDA-MB-231 ćelijama u poređenju sa PBS ili PBS plus laserom.obrađene ćelije.Međutim, kada je dodat Vc, stopa apoptoze RuDA i RuDA-NP značajno se smanjila sa 50,9% i 52,0% na 15,8% i 17,8%, respektivno, što potvrđuje važnu ulogu ROS u fotocitotoksičnosti RuDA i RuDA-NP..Osim toga, u svim testiranim grupama uočene su neznatne nekrotične ćelije (gornji lijevi kvadrant), što sugerira da apoptoza može biti dominantan oblik ćelijske smrti izazvane RuDA i RuDA-NP.
Pošto je oštećenje oksidativnim stresom glavna determinanta apoptoze, nuklearni faktor povezan sa eritroidom 2, faktorom 2 (Nrf2) 62, ključnim regulatorom antioksidativnog sistema, istražen je u MDA-MB-231 tretiranom RuDA-NPs.Mehanizam djelovanja RuDA NP induciranih zračenjem.Istovremeno je otkrivena i ekspresija nizvodne proteinske hem oksigenaze 1 (HO-1).Kao što je prikazano na slici 6F i dodatnoj slici 29, fototerapija posredovana RuDA-NP povećala je nivoe ekspresije Nrf2 i HO-1 u poređenju sa PBS grupom, što ukazuje da RuDA-NP mogu stimulirati signalne puteve oksidativnog stresa.Pored toga, da bi se proučavao fototermički efekat RuDA-NPs63, takođe je procenjena ekspresija proteina toplotnog šoka Hsp70.Jasno je da su ćelije tretirane RuDA-NP + 808 nm laserskim zračenjem pokazale povećanu ekspresiju Hsp70 u odnosu na druge dvije grupe, što odražava ćelijski odgovor na hipertermiju.
Izvanredni rezultati in vitro potaknuli su nas da istražimo in vivo performanse RuDA-NP kod golih miševa sa MDA-MB-231 tumorima.Distribucija RuDA NP u tkivu proučavana je određivanjem sadržaja rutenija u jetri, srcu, slezeni, bubrezima, plućima i tumorima.Kao što je prikazano na sl.7A, maksimalni sadržaj rudnih NP-a u normalnim organima pojavio se u trenutku prvog posmatranja (4 h), dok je maksimalni sadržaj određen u tumorskim tkivima 8 sati nakon injekcije, vjerovatno zbog rudnih NP-a.EPR efekat LF.Prema rezultatima distribucije, optimalno trajanje tretmana NP rudom uzeto je 8 sati nakon primjene.Da bi se ilustrovao proces akumulacije RuDA-NP na tumorskim mjestima, fotoakustička (PA) svojstva RuDA-NP-a su praćena snimanjem PA signala RuDA-NP-a u različito vrijeme nakon injekcije.Prvo, PA signal RuDA-NP in vivo je procijenjen snimanjem PA slika tumorskog mjesta nakon intratumoralne injekcije RuDA-NP.Kao što je prikazano na Dodatnoj slici 30, RuDA-NPs su pokazali jak PA signal, a postojala je pozitivna korelacija između koncentracije RuDA-NP i intenziteta PA signala (Dopunska slika 30A).Zatim su in vivo PA slike tumorskih mjesta snimljene nakon intravenske injekcije RuDA i RuDA-NP u različitim vremenskim točkama nakon injekcije.Kao što je prikazano na slici 7B, PA signal RuDA-NP sa tumorskog mjesta postepeno se povećavao s vremenom i dostigao plato 8 sati nakon injekcije, u skladu s rezultatima distribucije tkiva utvrđenim ICP-MS analizom.S obzirom na RuDA (dodatna slika 30B), maksimalni intenzitet PA signala pojavio se 4 sata nakon injekcije, što ukazuje na brzu brzinu ulaska RuDA u tumor.Osim toga, ispitivano je ponašanje izlučivanja RuDA i RuDA-NP određivanjem količine rutenija u urinu i fecesu korištenjem ICP-MS.Glavni put eliminacije za RuDA (dopunska slika 31) i RuDA-NP (slika 7C) je putem fecesa, a efektivno čišćenje RuDA i RuDA-NPs je uočeno tokom 8-dnevnog perioda istraživanja, što znači da je RuDA i RuDA-NP se mogu efikasno eliminisati iz organizma bez dugotrajne toksičnosti.
A. Ex vivo distribucija RuDA-NP u tkivima miša određena je sadržajem Ru (procenat primijenjene doze Ru (ID) po gramu tkiva) u različito vrijeme nakon injekcije.Podaci su srednja vrijednost ± standardna devijacija (n = 3). Neupareni, dvostrani t testovi *p < 0,05, **p < 0,01 i ***p < 0,001. Neupareni, dvostrani t testovi *p < 0,05, **p < 0,01 i ***p < 0,001. Neparnye dvustoronnie t-kriterije *p <0,05, **p <0,01 i ***p <0,001. Neupareni dvostrani t-testovi *p<0,05, **p<0,01 i ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。 Neparnye dvustoronnie t-testovi *p <0,05, **p <0,01 i ***p <0,001. Neupareni dvostrani t-testovi *p<0,05, **p<0,01 i ***p<0,001.B PA slike in vivo tumorskih mesta pri ekscitaciji od 808 nm nakon intravenske primene RuDA-NP (10 µmol kg-1) u različitim vremenskim tačkama.Nakon intravenske primjene RuDA NP (10 µmol kg-1), C Ru je izlučen iz miševa urinom i fecesom u različitim vremenskim intervalima.Podaci su srednja vrijednost ± standardna devijacija (n = 3).
Kapacitet grijanja RuDA-NP in vivo ispitan je na golim miševima sa MDA-MB-231 i RuDA tumorima radi poređenja.Kao što je prikazano na sl.8A i dodatna slika 32, kontrolna (fiziološka) grupa je pokazala manju promjenu temperature (ΔT ≈ 3 °C) nakon 10 minuta kontinuiranog izlaganja.Međutim, temperatura RuDA-NP-a i RuDA se brzo povećavala s maksimalnim temperaturama od 55,2 odnosno 49,9 °C, pružajući dovoljnu hipertermiju za in vivo terapiju raka.Uočeno povećanje visoke temperature za RuDA NP (ΔT ≈ 24°C) u poređenju sa RuDA (ΔT ≈ 19°C) može biti zbog njegove bolje permeabilnosti i akumulacije u tumorskim tkivima zbog EPR efekta.
Infracrvene termalne slike miševa sa MDA-MB-231 tumorima ozračenim laserom od 808 nm u različito vrijeme 8 sati nakon injekcije.Prikazane su reprezentativne slike četiri biološka ponavljanja iz svake grupe.B Relativni volumen tumora i C Prosječna masa tumora različitih grupa miševa tokom tretmana.D Krivulje tjelesne težine različitih grupa miševa.Zračiti laserom talasne dužine 808 nm snage 0,5 W/cm2 u trajanju od 10 minuta (300 J/cm2).Trake greške, srednja vrijednost ± standardna devijacija (n = 3). Neupareni, dvostrani t testovi *p < 0,05, **p < 0,01 i ***p < 0,001. Neupareni, dvostrani t testovi *p < 0,05, **p < 0,01 i ***p < 0,001. Neparnye dvustoronnie t-kriterije *p <0,05, **p <0,01 i ***p <0,001. Neupareni dvostrani t-testovi *p<0,05, **p<0,01 i ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。 Neparnye dvustoronnie t-testovi *p <0,05, **p <0,01 i ***p <0,001. Neupareni dvostrani t-testovi *p<0,05, **p<0,01 i ***p<0,001. E H&E bojenje slika glavnih organa i tumora iz različitih grupa tretmana, uključujući fiziološku otopinu, fiziološku otopinu + laser, RuDA, RuDA + laser, RuDA-NPs i RuDA-NPs + laserske grupe. E H&E bojenje slika glavnih organa i tumora iz različitih grupa tretmana, uključujući fiziološku otopinu, fiziološku otopinu + laser, RuDA, RuDA + laser, RuDA-NPs i RuDA-NPs + laserske grupe. Slika okrašivanja E H&E osnovnih organa i opuhola iz različitih grupa liječenja, uključujući grupe fizioloških otopina, fizioloških otopina + lasera, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NP i RuDA-NPs + Laser. E H&E bojenje slika glavnih organa i tumora iz različitih grupa tretmana, uključujući fiziološku otopinu, fiziološku otopinu + laser, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NP i RuDA-NP + Laser grupe.来自不同治疗组的主要器官和肿瘤的E H&E 染色图像，包括盐水、盐水、盐水、盐水、盐水、盐水、盐水、盐水、盐水、盐水、盐水、盐水、盐水、盐水、盐水、盐官官和肿瘤的E H&E + Ru DA-Ru NP-RuDA来自不同治疗组的主要器官和肿瘤的E H&E Okrašivanje E H&E osnovnih organa i opuhola iz različitih grupa liječenja, uključujući fiziološki rastvor, fiziološki rastvor + laser, RuDA, RuDA + laser, RuDA-NPs i RuDA-NPs + laser. E H&E bojenje glavnih organa i tumora iz različitih grupa tretmana uključujući fiziološku otopinu, fiziološku otopinu + laser, RuDA, RuDA + laser, RuDA-NPs i RuDA-NPs + laser.Skala bar: 60 µm.
Procijenjen je učinak fototerapije in vivo s RuDA i RuDA NPs u kojoj su goli miševi s MDA-MB-231 tumorima intravenozno ubrizgani RuDA ili RuDA NP u jednoj dozi od 10,0 µmol kg-1 preko repne vene, a zatim 8 sati nakon injekcije.lasersko zračenje talasne dužine 808 nm.Kao što je prikazano na slici 8B, volumen tumora je značajno povećan u grupama sa fiziološkom otopinom i laserom, što ukazuje da zračenje fiziološkom otopinom ili laserom 808 ima mali učinak na rast tumora.Kao iu grupi koja je primala fiziološku otopinu, brz rast tumora je također opažen kod miševa tretiranih RuDA-NP ili RuDA u odsustvu laserskog zračenja, što pokazuje njihovu nisku tamnu toksičnost.Nasuprot tome, nakon laserskog zračenja, i RuDA-NP i RuDA tretman izazvali su značajnu regresiju tumora sa smanjenjem volumena tumora od 95,2% i 84,3%, respektivno, u poređenju sa grupom koja je tretirana fiziološkim rastvorom, što ukazuje na odličan sinergistički PDT., posredovan efektom RuDA/CHTV.– NP ili Ore. U poređenju sa RuDA, RuDA NPs su pokazale bolji fototerapeutski efekat, što je uglavnom posledica EPR efekta RuDA NP.Rezultati inhibicije rasta tumora su dalje procijenjeni težinom tumora izrezanom 15. dana tretmana (slika 8C i dodatna slika 33).Srednja masa tumora kod miševa tretiranih RuDA-NP i miševa tretiranih RuDA bila je 0,08 i 0,27 g, respektivno, što je bilo mnogo manje nego u kontrolnoj grupi (1,43 g).
Osim toga, tjelesna težina miševa je zabilježena svaka tri dana kako bi se proučavala tamna toksičnost RuDA-NP ili RuDA in vivo.Kao što je prikazano na slici 8D, nisu uočene značajne razlike u tjelesnoj težini za sve tretirane grupe. Nadalje, obavljeno je bojenje hematoksilinom i eozinom (H&E) glavnih organa (srce, jetra, slezena, pluća i bubrezi) iz različitih tretiranih grupa. Nadalje, obavljeno je bojenje hematoksilinom i eozinom (H&E) glavnih organa (srce, jetra, slezena, pluća i bubrezi) iz različitih tretiranih grupa. Osim toga, sprovedeno je okrašivanje gematoksilinom i eozinom (H&E) osnovnih organa (serdca, pečenica, selezenki, lakih i počeka) iz različitih grupa lečenja. Osim toga, obavljeno je bojenje hematoksilinom i eozinom (H&E) glavnih organa (srce, jetra, slezina, pluća i bubrezi) iz različitih tretiranih grupa.此外,对不同治疗组的主要器官 (心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏、肺和肾脏）要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）和肾脏）和肾脏）进木瓉和肾脏) (H&E) Osim toga, provodili su okrašivanje gematoksilinom i eozinom (H&E) osnovnih organa (serdca, pečenica, selezenki, lakih i počeka) u različitim grupama liječenja. Pored toga, u različitim tretmanskim grupama izvršeno je bojenje hematoksilinom i eozinom (H&E) glavnih organa (srce, jetra, slezena, pluća i bubrezi).Kao što je prikazano na sl.8E, slike H&E bojenja pet glavnih organa iz grupa RuDA-NPs i RuDA ne pokazuju očigledne abnormalnosti ili oštećenja organa. 8E, slike H&E bojenja pet glavnih organa iz grupa RuDA-NPs i RuDA ne pokazuju očigledne abnormalnosti ili oštećenja organa.Kao što je prikazano na sl.8E, slike okrašivanja H&E pet osnovnih organa iz grupa RuDA-NP i RuDA ne pokazuju jave anomalije ili oštećene organe. 8E, slike H&E bojenja pet glavnih organa iz grupa RuDA-NPs i RuDA ne pokazuju očigledne abnormalnosti ili lezije organa.如图8E 所示，来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E 染色图像没有显夺出的的五个主要器官的H&E如图8E 所示，来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E Kao što je prikazano na crtežu 8E, slike okrašivanja H&E pet osnovnih organa iz grupa RuDA-NP i RuDA ne pokazuju jave anomalije ili oštećenja organa. Kao što je prikazano na slici 8E, slike H&E bojenja pet glavnih organa iz grupa RuDA-NPs i RuDA nisu pokazale očigledne abnormalnosti ili oštećenja organa.Ovi rezultati su pokazali da ni RuDA-NP ni RuDA nisu pokazali znakove toksičnosti in vivo. Štaviše, slike tumora H&E bojenjem su pokazale da i grupe RuDA + Laser i RuDA-NPs + Laser mogu uzrokovati ozbiljno uništavanje ćelija raka, pokazujući odličnu fototerapeutsku efikasnost RuDA i RuDA-NP-a in vivo. Štaviše, slike tumora H&E bojenjem su pokazale da i grupe RuDA + Laser i RuDA-NPs + Laser mogu uzrokovati ozbiljno uništavanje ćelija raka, pokazujući odličnu fototerapeutsku efikasnost RuDA i RuDA-NP-a in vivo.Pored toga, slike tumora obojene hematoksilinom-eozinom pokazale su da i RuDA+Laser i RuDA-NPs+Laser grupe mogu izazvati ozbiljno uništavanje ćelija raka, pokazujući superiornu fototerapeutsku efikasnost RuDA i RuDA-NP in vivo.此外, 肿瘤 的 h & e 染色 图像 显示, ruda + laser 和 ruda-nps + laser 组均 可 导致 严重 的 癌细胞 破坏, 证明 了 ruda 和 ruda-nps 的 优异 的 体内 光疗 功效.此外, 肿瘤 的 & e 染色 显示, ruda + laser 和 ruda-nps + laser 组均 导致 的 癌 细胞 破坏, 证明 了 ruda 和 ruda-nps 的 的 体内 光疗 ............. . . . .Osim toga, slike tumora obojene hematoksilinom i eozinom su pokazale da su i RuDA+Laser i RuDA-NPs+Laser grupe rezultirale teškim uništavanjem ćelija raka, pokazujući superiornu fototerapeutsku efikasnost RuDA i RuDA-NP in vivo.
U zaključku, Ru(II)-aren (RuDA) organometalni kompleks sa ligandima tipa DA dizajniran je da olakša ISC proces koristeći metodu agregacije.Sintetizirani RuDA se može samostalno sastaviti kroz nekovalentne interakcije kako bi formirao supramolekularne sisteme izvedene iz RuDA, čime se olakšava formiranje 1O2 i efikasna fototermalna konverzija za svjetlo-induciranu terapiju raka.Važno je napomenuti da monomerni RuDA nije generirao 1O2 pod laserskim zračenjem na 808 nm, ali je mogao generirati veliku količinu 1O2 u agregiranom stanju, što pokazuje racionalnost i efikasnost našeg dizajna.Naknadne studije su pokazale da supramolekularni sklop daje RuDA poboljšanim fotofizičkim i fotokemijskim svojstvima, kao što su apsorpcija crvenog pomaka i otpornost na fotobijeljenje, koji su vrlo poželjni za PDT i PTT obradu.Eksperimenti in vitro i in vivo pokazali su da RuDA NP sa dobrom biokompatibilnošću i dobrom akumulacijom u tumoru pokazuju odličnu antikancerogenu aktivnost izazvanu svjetlom nakon laserskog zračenja na talasnoj dužini od 808 nm.Dakle, RuDA NP kao efikasni bimodalni supramolekularni PDT/PTW reagensi će obogatiti set fotosenzibilizatora koji se aktiviraju na talasnim dužinama iznad 800 nm.Konceptualni dizajn supramolekularnog sistema obezbeđuje efikasan put za NIR aktivirane fotosenzibilizatore sa odličnim efektima fotosenzibilizacije.
Sve hemikalije i rastvarači su nabavljeni od komercijalnih dobavljača i korišteni bez daljnjeg pročišćavanja.RuCl3 je kupljen od Boren Precious Metals Co., Ltd. (Kunming, Kina).[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-fenantrolin-5,6-dion) i 4,7-bis[4-(N,N-difenilamino)fenil]-5 ,6-Diamino-2,1,3-benzotiadiazol je sintetizovan prema prethodnim studijama64,65.NMR spektri su snimljeni na spektrometru Bruker Avance III-HD 600 MHz u analitičkom test centru Southeastern University koristeći d6-DMSO ili CDCl3 kao rastvarač.Hemijski pomaci δ su dati u ppm.u odnosu na tetrametilsilan, a konstante interakcije J su date u apsolutnim vrijednostima u hercima.Masena spektrometrija visoke rezolucije (HRMS) izvedena je na Agilent 6224 ESI/TOF MS instrumentu.Elementarna analiza C, H i N izvedena je na elementnom analizatoru Vario MICROCHNOS (Elementar).UV-vidljivi spektri su mjereni na spektrofotometru Shimadzu UV3600.Fluorescencijski spektri su snimljeni na Shimadzu RF-6000 spektrofluorimetru.EPR spektri su snimljeni na instrumentu Bruker EMXmicro-6/1.Morfologija i struktura pripremljenih uzoraka proučavana je na instrumentima FEI Tecnai G20 (TEM) i Bruker Icon (AFM) koji rade na naponu od 200 kV.Dinamičko raspršivanje svjetlosti (DLS) izvedeno je na Nanobrook Omni analizatoru (Brookhaven).Fotoelektrohemijska svojstva su izmjerena na elektrohemijskoj postavci (CHI-660, Kina).Fotoakustične slike su dobijene korišćenjem FUJIFILM VisualSonics Vevo® LAZR sistema.Konfokalne slike su dobijene pomoću konfokalnog mikroskopa Olympus FV3000.FACS analiza je izvršena na BD Calibur protočnom citometru.Eksperimenti tečne hromatografije visokih performansi (HPLC) izvedeni su na sistemu Waters Alliance e2695 koristeći 2489 UV/Vis detektor.Testovi gel permeacijske hromatografije (GPC) su snimljeni na Thermo ULTIMATE 3000 instrumentu koristeći ERC RefratoMax520 detektor indeksa refrakcije.
[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-fenantrolin-5,6-dion)64 (481,0 mg, 1,0 mmol), 4,7-bis[4 -(N, N-difenilamino)fenil]-5,6-diamino-2,1,3-benzotiadiazol 65 (652,0 mg, 1,0 mmol) i glacijalna sirćetna kiselina (30 mL) su mešani u refluksnom frižideru 12 sati.Rastvarač je zatim uklonjen u vakuumu pomoću rotacionog isparivača.Dobijeni ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na koloni (silika gel, CH2Cl2:MeOH=20:1) da se dobije RuDA kao zeleni prah (prinos: 877,5 mg, 80%).analni otvor.Izračunato za C64H48Cl2N8RuS: C 67,84, H 4,27, N 9,89.Pronađeno: C 67,92, H 4,26, N 9,82.1H NMR (600 MHz, d6-DMSO) δ 10,04 (s, 2H), 8,98 (s, 2H), 8,15 (s, 2H), 7,79 (s, 4H), 7,44 (s, 8H), 7,21 (d, J = 31,2 Hz, 16H), 6,47 (s, 2H), 6,24 (s, 2H), 2,69 (s, 1H), 2,25 (s, 3H), 0,99 (s, 6H).13c NMR (150 MHz, D6-DMSO), Δ (PPM) 158.03, 152.81, 149.16, 139.98, 136.21, 135.57, 134,68, 130,34, 130,02, 128,68, 128,01, 120,81, 103,45, 103,49, 103,49, 103,49 , 103. , 86.52, 84.75, 63.29, 30.90, 22.29, 18.83.ESI-MS: m/z [M-Cl]+ = 1097,25.
Sinteza 4,7-bis[4-(N,N-dietilamino)fenil-5,6-diamino-2,1,3-benzotiadiazola (L2): L2 je sintetizovan u dva koraka.Pd(PPh3)4 (46 mg, 0,040 mmol) je dodat u N,N-dietil-4-(tributilstanil)anilin (1,05 g, 2,4 mmol) i 4,7-dibromo-5,6-dinitro rastvor - 2, 1,3-benzotiadiazol (0,38 g, 1,0 mmol) u suvom toluenu (100 ml).Smeša je mešana na 100°C tokom 24 sata.Nakon uklanjanja toluena u vakuumu, nastala čvrsta supstanca je isprana petroleterom.Zatim je mešavina ovog jedinjenja (234,0 mg, 0,45 mmol) i praha gvožđa (0,30 g, 5,4 mmol) u sirćetnoj kiselini (20 ml) mešana na 80°C tokom 4 sata.Reakciona smeša je izlivena u vodu i nastala smeđa čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom.Produkt je prečišćen dva puta sublimacijom u vakuumu da bi se dobila zelena čvrsta supstanca (126,2 mg, 57% prinos).analni otvor.Izračunato za C26H32N6S: C 67,79, H 7,00, N 18,24.Pronađeno: C 67,84, H 6,95, H 18,16.1H NMR (600 MHz, CDCl3), δ (ppm) 7,42 (d, 4H), 6,84 (d, 4H), 4,09 (s, 4H), 3,42 (d, 8H), 1,22 (s, 12H).13S NMR (150 MHz, CDCl3), δ (ppm) 151,77, 147,39, 138,07, 131,20, 121,09, 113,84, 111,90, 44,34, 12,77.ESI-MS: m/z [M+H]+ = 461,24.
Jedinjenja su pripremljena i pročišćena slijedeći procedure slične RuDA.analni otvor.Izračunato za C48H48Cl2N8RuS: C 61,27, H 5,14, N 11,91.Pronađeno: C, 61,32, H, 5,12, N, 11,81, 1H NMR (600 MHz, d6-DMSO), δ (ppm) 10,19 (s, 2H), 9,28 (s, 2H), 8,09 (s, 2H), 7,95 (s, 4H), 6,93 (s, 4H), 6,48 (d, 2H), 6,34 (s, 2H), 3,54 (t, 8H), 2,80 (m, 1H), 2,33 (s, 3H), 1,31 (t, 12H), 1,07 (s, 6H).13c NMR (151 MHz, CDCL3), Δ (PPM) 158.20, 158.14, 138.82, 136.79, 135.75, 138.71, 130.44, 128.70, 111.84, 110.76, 105.07, 104.23, 87.0, 84.4., 38.06, 31.22, 29.69, 22.29, 19.19, 14.98, 12.93.ESI-MS: m/z [M-Cl]+ = 905,24.
RuDA je otopljen u MeOH/H2O (5/95, v/v) u koncentraciji od 10 μM.Spektar apsorpcije RuDA mjeren je svakih 5 minuta na spektrofotometru Shimadzu UV-3600 pod zračenjem laserskom svjetlošću talasne dužine od 808 nm (0,5 W/cm2).ICG spektri su snimljeni pod istim uslovima kao i standard.
EPR spektri su snimljeni na spektrometru Bruker EMXmicro-6/1 sa mikrovalnom snagom od 20 mW, opsegom skeniranja od 100 G i modulacijom polja od 1 G. 2,2,6,6-tetrametil-4-piperidon (TEMP) i 5,5-dimetil-1-pirolin N-oksid (DMPO) korišteni su kao spin zamke.Spektri elektronske spinske rezonancije snimljeni su za miješane otopine RuDA (50 µM) i TEMF (20 mM) ili DMPO (20 mM) pod djelovanjem laserskog zračenja talasne dužine 808 nm (0,5 W/cm2).
DFT i TD-DFT proračuni za RuDA izvedeni su na nivoima PBE1PBE/6–31 G*//LanL2DZ u vodenom rastvoru koristeći Gaussov program 1666,67,68.Distribucija HOMO-LUMO, rupa i elektrona niskoenergetskog singletnog pobuđenog stanja RuDA nacrtana je pomoću GaussView programa (verzija 5.0).
Prvo smo pokušali da izmerimo efikasnost generisanja 1O2 RuDA korišćenjem konvencionalne UV-vidljive spektroskopije sa ICG (ΦΔ = 0,002) kao standardom, ali je fotodegradacija ICG snažno uticala na rezultate.Tako je kvantni prinos 1O2 RuDA mjeren detekcijom promjene intenziteta ABDA fluorescencije na oko 428 nm kada je zračen laserom talasne dužine od 808 nm (0,5 W/cm2).Eksperimenti su izvedeni na RuDA i RuDA NP (20 μM) u vodi/DMF (98/2, v/v) koji sadrži ABDA (50 μM).Kvantni prinos 1O2 je izračunat korišćenjem sledeće formule: ΦΔ (PS) = ΦΔ (ICG) × (rFS/APS)/(rICG/AICG).rPS i rICG su stope reakcije ABDA sa 1O2 dobijene od fotosenzibilizatora i ICG-a, respektivno.APS i AICG su apsorpcija fotosenzibilizatora i ICG na 808 nm, respektivno.
AFM mjerenja su obavljena u tekućim uvjetima korištenjem režima skeniranja na Bruker Dimension Icon AFM sistemu.Koristeći otvorenu strukturu sa tečnim ćelijama, ćelije su dva puta isprane etanolom i osušene strujom azota.Umetnite osušene ćelije u optičku glavu mikroskopa.Odmah stavite kap uzorka u bazen tečnosti i stavite je na konzolu pomoću sterilne plastične šprice za jednokratnu upotrebu i sterilne igle.Druga kap se stavlja direktno na uzorak, a kada se optička glava spusti, dvije kapi se spajaju, formirajući meniskus između uzorka i rezervoara za tečnost.AFM mjerenja su izvršena pomoću SCANASYST-FLUID V-oblika nitridne konzole (Bruker, tvrdoća k = 0,7 N m-1, f0 = 120–180 kHz).
HPLC hromatogrami su dobijeni na Waters e2695 sistemu opremljenom phoenix C18 kolonom (250×4,6 mm, 5 µm) korišćenjem 2489 UV/Vis detektora.Talasna dužina detektora je 650 nm.Mobilne faze A i B bile su voda i metanol, respektivno, a brzina protoka mobilne faze bila je 1,0 ml·min-1.Gradijent (rastvarač B) je bio sledeći: 100% od 0 do 4 minuta, 100% do 50% od 5 do 30 minuta i resetovanje na 100% od 31 do 40 minuta.Ruda je otopljena u miješanoj otopini metanola i vode (50/50, zapreminski) u koncentraciji od 50 μM.Zapremina injekcije bila je 20 μl.
GPC testovi su snimljeni na Thermo ULTIMATE 3000 instrumentu opremljenom sa dvije PL aquagel-OH MIXED-H kolone (2×300×7,5 mm, 8 µm) i ERC RefratoMax520 detektorom indeksa refrakcije.GPC kolona je eluirana vodom pri brzini protoka od 1 ml/min na 30°C.NP rude su rastvoreni u rastvoru PBS (pH = 7,4, 50 μM), zapremina ubrizgavanja je 20 μL.
Fotostruje su mjerene na elektrohemijskoj postavci (CHI-660B, Kina).Optoelektronski odgovori kada je laser bio uključen i isključen (808 nm, 0,5 W/cm2) mjereni su pri naponu od 0,5 V u crnoj kutiji, respektivno.Korištena je standardna troelektrodna ćelija sa staklenom ugljeničnom elektrodom u obliku slova L (GCE) kao radnom elektrodom, standardnom kalomelnom elektrodom (SCE) kao referentnom elektrodom i platinastim diskom kao kontraelektrodom.Kao elektrolit korišćen je 0,1 M rastvor Na2SO4.
Ćelijska linija raka dojke kod ljudi MDA-MB-231 kupljena je od KeyGEN Biotec Co., LTD (Nanjing, Kina, kataloški broj: KG033).Ćelije su uzgajane u monoslojevima u Dulbecco-ovom modificiranom orlovom mediju (DMEM, visoka glukoza) dopunjenom otopinom 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS), penicilina (100 μg/ml) i streptomicina (100 μg/ml).Sve ćelije su uzgajane na 37°C u vlažnoj atmosferi koja sadrži 5% CO2.
MTT test je korišćen za određivanje citotoksičnosti RuDA i RuDA-NP u prisustvu i odsustvu svetlosnog zračenja, sa ili bez Vc (0,5 mM).MDA-MB-231 ćelije raka su uzgajane u pločama sa 96 jažica pri gustini ćelija od približno 1 x 105 ćelija/ml/jažici i inkubirane 12 sati na 37,0°C u atmosferi od 5% CO2 i 95% vazduha.U ćelije su dodani RuDA i RuDA NP-ovi rastvoreni u vodi.Nakon 12 sati inkubacije, ćelije su izložene laserskom zračenju od 0,5 W cm -2 na talasnoj dužini od 808 nm tokom 10 minuta (300 J cm -2), a zatim inkubirane u mraku 24 sata.Ćelije su zatim inkubirane sa MTT (5 mg/ml) još 5 sati.Na kraju, promijenite medij u DMSO (200 µl) kako biste otopili rezultirajuće ljubičaste kristale formazana.Vrijednosti OD-a mjerene su pomoću čitača mikroploče s talasnom dužinom od 570/630 nm.Vrijednost IC50 za svaki uzorak izračunata je korištenjem SPSS softvera iz krivulja doza-odgovor dobijenih iz najmanje tri nezavisna eksperimenta.
MDA-MB-231 ćelije su tretirane RuDA i RuDA-NP u koncentraciji od 50 μM.Nakon 12 sati inkubacije, ćelije su ozračene laserom talasne dužine 808 nm i snage 0,5 W/cm2 tokom 10 minuta (300 J/cm2).U grupi sa vitaminom C (Vc), ćelije su tretirane sa 0,5 mM Vc pre laserskog zračenja.Ćelije su zatim inkubirane u mraku dodatna 24 sata, zatim obojene kalceinom AM i propidijum jodidom (20 μg/ml, 5 μl) 30 minuta, zatim isprane sa PBS (10 μl, pH 7,4).slike obojenih ćelija.
Vrijeme objave: Sep-23-2022
