Vijesti

Hvala vam što ste posjetili Nature.com.Verzija pretraživača koju koristite ima ograničenu podršku za CSS.Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažurirani pretraživač (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru).U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Ćelije raka razvile su različite mehanizme kako bi prevladale ćelijski stres i nastavile napredovati.Protein kinaza R (PKR) i njen proteinski aktivator (PACT) su početni odgovornici koji prate različite signale stresa koji dovode do inhibicije proliferacije i apoptoze ćelije.Međutim, regulacija PACT-PKR puta u ćelijama raka ostaje uglavnom nepoznata.Ovdje smo otkrili da je duga nekodirajuća RNA (lncRNA) aspartil tRNA sintetaza antisens RNA 1 (DARS-AS1) direktno uključena u inhibiciju PACT-PKR puta i promovira proliferaciju stanica raka.Koristeći veliki funkcionalni skrining CRISPRi 971 lncRNA povezane s rakom, otkrili smo da je DARS-AS1 povezan sa značajno povećanom proliferacijom stanica raka.Stoga, DARS-AS1 nokaut inhibira proliferaciju stanica i promovira apoptozu stanica raka u različitim ćelijskim linijama raka in vitro i značajno smanjuje rast tumora in vivo.Mehanički, DARS-AS1 se direktno vezuje za PACT aktivacioni domen i sprečava PACT-PKR interakciju, čime se smanjuje aktivacija PKR, fosforilacija eIF2α i inhibiranje apoptotske ćelijske smrti.Klinički, DARS-AS1 je široko izražen u više vrsta raka, a prekomjerna ekspresija ove lncRNA ukazuje na lošu prognozu.Ova studija razjašnjava specifičnu regulaciju PACT-PKR puta putem DARS-AS1 lncRNA i pruža još jednu metu za prognozu i liječenje raka.
Sposobnost prilagođavanja stresu je važna karakteristika preživljavanja i proliferacije ćelija raka.Brza proliferacija i metabolička obilježja raka dostižu vrhunac u teškim mikrookruženjima – nedostatak nutrijenata, hipoksija i nizak pH – koji mogu pokrenuti signalne puteve ćelijske smrti.Disregulacija gena osjetljivih na stres kao što su p535, proteini toplotnog šoka 6, 7, KRAS8, 9 i HIF-110, 11, 12, 13 često se primjećuje kod raka, čime se blokira apoptoza i promovira preživljavanje.
Protein kinaza R (PKR) je važan senzor stresa i podjedinica kinaze eukariotskog inicijacionog faktora 2α (eIF2α), translacionog regulatora koji povezuje ćelijski stres sa ćelijskom smrću.PKR je prvobitno identificiran kao antivirusni protein detekcijom strane dvolančane RNK (dsRNA).Nakon aktivacije, PKR fosforilira eIF2α da inhibira virusnu i ćelijsku sintezu proteina14,15,16.PACT (PKR aktivator protein) je identificiran kao prvi PKR aktivator protein u odsustvu dsRNA17,18,19,20,21,22,23.Kroz direktnu interakciju sa PKR, PACT prenosi različite stresove (izgladnjivanje serumom, tretman peroksidom ili arsenitom) na PKR i nizvodne signalne puteve.Pored fosforilacije eIF2α, PACT posredovana PKR aktivacija pokreće različite događaje povezane s odgovorom na stres, uključujući izmijenjen redoks status putem PI3K/Akt24 puta, poboljšanu provjeru oštećenja DNK putem p5325,26 i NF-κB27,28 Reguliše transkripciju, 29. S obzirom na njihovu kritičnu ulogu u odgovoru na stres, proliferaciji, apoptozi i drugim ključnim ćelijskim procesima, PKR i PACT su obećavajući terapeutski ciljevi za mnoge bolesti, posebno rak30,31,32,33.Međutim, uprkos ovom pleiotropnom funkcionalnom i biološkom značaju, regulacija PACT/PKR aktivnosti u ćelijama raka ostaje neuhvatljiva.
lncRNA su transkripti veći od 200 nukleotida bez potencijala za kodiranje proteina.Otkako su najmoderniji projekti sekvenciranja cijelog genoma identificirali hiljade lncRNA,35,36 uloženo je mnogo napora da se razjasne njihove biološke funkcije.Sve veći broj istraživanja je pokazao da su lncRNA uključene u mnoge biološke procese37 uključujući regulaciju inaktivacije X-hromozoma38,39, utiskivanje40, transkripciju41,42, translaciju43, pa čak i rast raka44,45,46,47.Ove studije su izvijestile da su mnoge lncRNA uključene u PACT/PKR put.Jedna takva studija pokazala je da lncRNA ASPACT inhibira PACT transkripciju i povećava nuklearno zadržavanje PACT mRNA.Druge studije su pokazale da se lncRNA nc886 vezuje za PKR i inhibira njegovu fosforilaciju49,50.Do sada nije prijavljeno da lncRNA reguliše PKR aktivaciju posredovanu PACT-om.
Aspartil-tRNA sintetaza antisense RNA 1 (DARS-AS1) je identificirana kao onkogena lncRNA51,52,53,54.Kroz regulaciju miP-194-5p53, miP-12952 i miP-532-3p51, pokazalo se da DARS-AS1 podstiče rast karcinoma bubrežnih ćelija bistrih ćelija, karcinoma štitne žlezde i karcinoma pluća ne-malih ćelija.Tong i kolege su također otkrili da DARS-AS1 promovira progresiju mijeloma održavajući stabilnost RNA-vezujućeg motiva proteina 39 (RBM39).Međutim, nisu sprovedene studije o tome da li je ova lncRNA uključena u regulaciju PACT-PKR aktivacije i stresnog odgovora ćelija raka.
Ovdje smo izvršili veliki pregled gubitka funkcije koristeći CRISPRi sistem i utvrdili da DARS-AS1 lncRNA promovira proliferaciju nekoliko tipova ćelija raka.Pored toga, identifikovali smo glavni mehanizam: DARS-AS1 se direktno vezuje za PACT, inhibira PACT i PKR vezivanje, sprečava fosforilaciju eIF2α, nižeg PKR supstrata, i na kraju inhibira apoptotičku smrt ćelija.Zaključno, naš rad otkriva DARS-AS1 lncRNA kao regulator PACT-PKR puta i potencijalnu metu za liječenje i prognozu raka.
Opsežne studije genomskog profiliranja identificirale su stotine lncRNA povezanih s rakom.Međutim, njihova funkcija ostaje uglavnom nepoznata56.Da bismo identifikovali obećavajuće kandidate za lncRNA koji su uključeni u progresiju raka, izvršili smo skrining gubitka funkcije za smanjenu proliferaciju u ćelijskoj liniji kolorektalnog karcinoma SW620 koristeći CRISPRi sistem (slika 1a).Jedinstvena karakteristika ćelijskih linija raka debelog crijeva SW480 i SW620 je da su izvedene iz primarnih i sekundarnih tumora kod jednog pacijenta.Ovo pruža vrijednu usporedbu za proučavanje genetskih promjena u napredovanju uznapredovalog raka debelog crijeva.Stoga smo analizirali transkriptome ćelijskih linija kolorektalnog karcinoma (SW480 i SW620) korištenjem RNA sekvenciranja i prikupili neke potencijalne funkcionalne lncRNA iz objavljene literature.Na osnovu ovih rezultata dizajnirali smo objedinjenu sgRNA biblioteku koja sadrži 7355 sgRNA oligoa koji ciljaju 971 lncRNA povezanih s rakom i 500 neciljanih sgRNA oligoa za negativnu kontrolu (dodatni podaci 1).
Šematski prikaz skrininga pomoću CRISPRi sistema.b sgRNA obogaćivanje nakon skrininga.Horizontalna isprekidana linija predstavlja log2 (promjena puta) = ±0,58.Vertikalna isprekidana linija označava p vrijednost = 0,05.Crne tačke predstavljaju neciljnu sgRNA (označena kao NC).Crvene tačke su sgRNA koje ciljaju DARS-AS1.Plave tačke su sgRNA koje ciljaju LINC00205, prethodno opisanu onkogenu lncRNA.fold change = (normalizovano očitavanje, dan 17)/(normalizovano očitavanje, dan 0).c Nokdaun DARS-AS1 sgRNA je inhibirao rast ćelija.Trake grešaka predstavljaju ± standardnu ​​devijaciju tri eksperimenta.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 dvostrani Studentov t-test.d Ekspresija DARS-AS1 u tumorima (TCGA skup podataka).em Ekspresija DARS-AS1 u uparenim normalnim i tumorskim uzorcima pacijenata sa BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP i COAD, respektivno (TCGA skup podataka).p-vrijednosti su dobijene pomoću uparenog dvostranog Studentovog t-testa.
Nakon konstruisanja plazmida i pakovanja lentivirusa, transducirali smo dCas9-SW620 ćelijsku liniju kolorektalnog karcinoma sa gornjom bibliotekom u četiri nezavisna eksperimenta infekcije.Višestrukost infekcije (MOI) za ove infekcije bila je 0,1-0,3, što ukazuje da svaka ćelija može biti transficirana samo jednom sgRNA.Nakon 18 dana in vitro kulture, profil obogaćivanja ciljnih sgRNA se smanjio ili povećao nakon skrininga, dok je broj neciljanih kontrolnih oligonukleotida ostao relativno nepromijenjen u poređenju s profilom prije skrininga, što ukazuje da naš cilj ima visoko specifičan skrining. biblioteka.Rice.1b i dopunska tabela 1). LINC00205, za koji je ranije prijavljeno da promovira rak pluća i progresiju raka jetre58,59,60, je skriniran (log2 (promjena puta) < -0,58, p vrijednost <0,05, potvrđujući pouzdanost ovog skrininga (Slika 1b). LINC00205, za koji je ranije prijavljeno da promovira rak pluća i progresiju raka jetre58,59,60, je skriniran (log2 (promjena puta) < -0,58, p vrijednost <0,05, potvrđujući pouzdanost ovog skrininga (Slika 1b). LINC00205, kao što je ranije objavljeno, da on pomaže napredovanje lakih i raka pečenih58, 59, 60, isključen je (log2 (kratka izmjena) <-0,58, vrijednost p <0,05), što potvrđuje pouzdanost ovog skrininga (ris 1b). LINC00205, za koji je ranije objavljeno da promoviše napredovanje raka pluća i raka jetre58,59,60, isključen je (log2 (promjena puta) <-0,58, p-vrijednost <0,05, potvrđujući robusnost ovog skrininga (Sl. 1b) . Linc00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 进展 58,59,60, 被 筛 选 掉 (Log2 (倍数 变化) <-0.58, p 值 <0,05), 证实 了 该 筛选 的 可靠性 (图 1b). Linc00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 进展 58,59,60, 被 筛 选 掉 (Log2 (倍数 变化) <-0.58, p 值 <0,05), 证实 了 该 筛选 的 可靠性 (图 1b). LINC00205, kao što je ranije objavljeno, da on pomaže napredovanje lakih i pečenih raka58, 59, 60, isključen je (log2 (kratka izmjena) <-0,58, p-značenje <0,05), što potvrđuje pouzdanost ovog skrininga (ris 1b). LINC00205, za koji je ranije prijavljeno da podstiče progresiju raka pluća i jetre58,59,60, isključen je (log2 (promena puta) <-0,58, p-vrijednost <0,05, potvrđujući robusnost ovog skrininga (Sl. 1b).
Među svim testiranim lncRNA, DARS-AS1 je također pregledan, sa tri srodna sgRNA oligonukleotida značajno smanjena nakon 18 dana kulture, što sugerira da je obaranje ove lncRNA rezultiralo smanjenom proliferacijom raka (slika 1b).Ovaj rezultat je dodatno podržan MTS analizom u ćelijama kolorektalnog raka koja pokazuje da je stopa rasta DARS-AS1 oborenih ćelija samo prepolovljena u poređenju sa kontrolnim ćelijama (slika 1c) i bila je u skladu sa prethodnim izveštajima o nekoliko drugih tipova raka.: bistrocelularni karcinom bubrega, karcinom štitne žlezde i karcinom pluća ne-malih ćelija51,52,53,55.Međutim, njegova funkcija i molekularni mehanizmi kod kolorektalnog karcinoma ostaju neistraženi.Stoga smo odabrali ovu lncRNA za dalje proučavanje.
Da bismo proučavali ekspresiju DARS-AS1 kod pacijenata, sveobuhvatno smo analizirali 10.327 uzoraka tumora iz projekta Atlas genoma raka (TCGA).Naši rezultati pokazuju da je DARS-AS1 široko eksprimiran i značajno pojačan u zdravim stanicama u različitim tumorima, uključujući adenokarcinom debelog crijeva (COAD), karcinom renalnih bistrih stanica (KIRC) i karcinom papilarnih stanica bubrega (KIRP)..Vrlo malo (slika 1d i dopunska slika 1a, b). Analiza uparenih zdravih/tumorskih uzoraka dalje je potvrdila značajno veću ekspresiju DARS-AS1 u tumorima urotelnog karcinoma mokraćne bešike (BLCA), karcinoma bubrega bubrega (KIRC), adenokarcinoma prostate (PRAD), karcinoma skvamoznih ćelija pluća (LUSC) , karcinom endometrijuma korpusa materice (UCEC), adenokarcinom pluća (LUAD), hepatocelularni karcinom jetre (LIHC), karcinom bubrežnih papilarnih ćelija (KIRP) i adenokarcinom debelog creva (COAD) (p vrednost < 0,05–m) (Sl. 1e) (Sl. 1e) . Analiza uparenih zdravih/tumorskih uzoraka dalje je potvrdila značajno veću ekspresiju DARS-AS1 u tumorima urotelnog karcinoma mokraćne bešike (BLCA), karcinoma bubrega bubrega (KIRC), adenokarcinoma prostate (PRAD), karcinoma skvamoznih ćelija pluća (LUSC) , karcinom endometrijuma korpusa materice (UCEC), adenokarcinom pluća (LUAD), hepatocelularni karcinom jetre (LIHC), karcinom bubrežnih papilarnih ćelija (KIRP) i adenokarcinom debelog creva (COAD) (p vrednost < 0,05–m) (Sl. 1e) (Sl. 1e) .Analiza uparenih zdravih/tumorskih uzoraka također je potvrdila značajno veću ekspresiju DARS-AS1 u tumorima urotelnog karcinoma mokraćne bešike (BLCA), karcinoma bubrega i bubrežnih ćelija (KIRC), adenokarcinoma prostate (PRAD), karcinoma skvamoznih ćelija pluća (LUSC)., karcinoma éndometrija tela matki (UCEC), adenokarcinoma legkog (LUAD), gepatocelularnog karcinoma pečenog (LIHC), papilarno-kletočnog karcinoma počki (KIRP) i adenokarcinoma tolstoj kiški (COAD) (značenje p <0,05) (ris. m) . , karcinom endometrijuma korpusa materice (UCEC), adenokarcinom pluća (LUAD), hepatocelularni karcinom jetre (LIHC), karcinom papilarnih ćelija bubrega (KIRP) i adenokarcinom debelog creva (COAD) (p vrednost < 0,05) (sl. 1e–m) .配对 健康 / 肿瘤样 肿瘤样 的 分析 证实 证实 了 上 皮癌 在 膀胱 尿路 上 皮癌 (BLCA), 肾 肾 透明 细胞癌 (Kirc), 前列 腺腺癌 (PRAD), 肺鳞状 细胞癌 (Luc) 肿瘤 中 的显着 更 高 表达, 子宫体子宫 内膜 癌 (Ucec), 肺腺癌 (Luad), 肝肝 细胞癌 (LIHC), 肾 肾 乳头状 细胞癌 (Kirp) 和结肠腺癌 (Coad) (P 值<0,05） (图1e-m) .配 对 健康 / 肿瘤样 肿瘤样 的 证实 了 Dars-OS1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌, 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 (PRAD), 细胞癌 细胞癌(Lusc) 肿瘤 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 显着 更 高 表达, 内膜 更 ((Ucel) 肺腺癌 (Luad) 肝肝 细胞癌 (LIHC) 肾 肾 乳头状 细胞癌 (kirp) (coad) (p 值<0,05) (图1e-m) .Analiza uparenih uzoraka zdrav/tumor dodatno je podržala ulogu DARS-AS1 u tumorima urotelnog karcinoma mokraćne bešike (BLCA), karcinoma renalnih ćelija svetlih ćelija (KIRC), adenokarcinoma prostate (PRAD) i karcinoma skvamoznih ćelija pluća (LUSC).ekspresija pri karcinoma tela matki (UCEC), adenokarcinoma legkog (LUAD), gepatocelularnog karcinoma (LIHC), počečno-počečnoj papiljarno-kletočne karcinome (KIRP) i adenokarcinoma tolstoj kiški (COAD) (značenje p <0,05) (ris. 1 -m). ekspresija u korpusnom karcinomu materice (UCEC), adenokarcinomu pluća (LUAD), hepatocelularnom karcinomu (LIHC), karcinomu papilarnih ćelija bubrega (KIRP) i adenokarcinomu debelog creva (COAD) (p vrednost <0,05) (Slika 1e-m).Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju da je DARS-AS1 široko i visoko izražen u različitim vrstama raka.
Budući da DARS-AS1 i DARS (gen koji kodira antisense lanac) dijele isti promotor i nalaze se jedan pored drugog, dizajnirali smo shRNA da specifično sruši DARS-AS1, ali ne i DARS (dodatna slika 2a,b i dodatna tabela 2) .Pored SW620, koristili smo i tri druge ćelijske linije koje visoko eksprimiraju DARS-AS1 za proučavanje efikasnosti i funkcije shRNA knockdowna (dodatna tabela 3).Naši rezultati su pokazali da su sve tri razvijene shRNA postigle najmanje 80% efikasnosti uništavanja DARS-AS1 sa malim utjecajem na količinu DARS mRNA (dodatna slika 2c-f).Pored toga, otkrili smo da DARS-AS1 nokdaun sa ovim shRNA značajno inhibira rast ćelija u ćelijskim linijama kolorektalnog karcinoma SW620 (49,7%) i HCT116 (27,7%), ćelijskoj liniji raka dojke MBA-MD-231 (53,4%).) i HepG2 ćelijsku liniju hepatoma (smanjenje od 92,7%), kao i njihovu sposobnost da formiraju neusidrene sfere (prosječno smanjenje od ~50,8%, 44,6%, 40,7% i 75,7% po ćelijskoj liniji) (slika 2a,b).U SW620, rezultati analize formiranja kolonija dalje su potvrdili da DARS-AS1 shRNA značajno inhibira proliferaciju ćelija sa prosječnim smanjenjem od približno 69,6% (slika 2c).
Učinak kontrolne shRNA i DARS-AS1 shRNA na ćelijsku proliferaciju (a) i formiranje sferoida (b) u ćelijama SW620, HCT116, MBA-MD-231 i HepG2.c Efekat kontrolne shRNA i DARS-AS1 shRNA na formiranje kolonija u ćelijama SW620.Proliferacija ćelija (d), formiranje sferoida (e) i formiranje kolonija (f) ćelija SW620 koje prekomerno eksprimiraju DARS-AS1.Prikazani podaci su srednja vrijednost ± standardna devijacija tri eksperimenta.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 i *** p ≤ 0,001 dvostranim Studentovim t-testom.
Da bismo nadopunili studije gubitka funkcije, zatim smo kreirali ćelije SW620 koje prekomjerno eksprimiraju DARS-AS1 (dopunska slika 2g).Prekomjerna ekspresija DARS-AS1 značajno je povećala rast ćelija (1,8 puta), formiranje neusklađenih sferoida (1,4 puta) i formiranje kolonija (3,3 puta) u ćelijama SW620 (Slika 2d–f).Ovaj rezultat smo potvrdili koristeći drugu DARS-AS1 ćelijsku liniju, A549.Ova pojačana ćelijska proliferacija zbog prekomjerne ekspresije DARS-AS1 dalje je uočena u A549 ćelijama (dodatna slika 2h, i i dodatna tabela 3).Uzeti zajedno, ove studije dobitka i gubitka pokazuju da DARS-AS1 promoviše proliferaciju ćelija raka in vitro.
Da bismo istražili osnovni mehanizam pomoću kojeg DARS-AS1 reguliše proliferaciju ćelija, izvršili smo analizu RNK-a kako bismo identifikovali potencijalne partnere koji se vezuju za proteine.RT-qPCR rezultati su pokazali da se oko 86,2% DARS-AS1 nalazi u citoplazmi SW620 ćelija (dopunska slika 3a).In vitro transkribovani biotinilirani DARS-AS1 ili pseudoRNA je zatim inkubiran sa SW620 ćelijskim lizatima nakon čega je uslijedilo odvajanje SDS-PAGE.Naknadno bojenje srebrom pokazalo je da je različita traka (~38 kDa) bila značajno obogaćena u DARS-AS1 vučenim uzorcima, ali ne i u uzorcima lažne RNK ili kuglica (slika 3a).Ova traka je identifikovana kao protein koji aktivira PKR (PACT) masenom spektrometrijom (MS) i dalje potvrđena imunoblotingom u SW620, HCT116 i HepG2 ćelijskim linijama (slika 3a,b).Obogaćivanje DARS i srodnih PACT proteina – PKR i TRBP – također je istraženo korištenjem RNA analize pomoću Western blotting (WB).Rezultati su pokazali da nije pronađena direktna interakcija između DARS-AS1 RNK i ova tri proteina (dopunska slika 3b).Specifična interakcija između DARS-AS1 i PACT dodatno je potvrđena analizom RNA imunoprecipitacije (RIP), koja je pokazala da je DARS-AS1 značajno obogaćen anti-PACT antitelima, ali ne i drugim kontrolnim RNK (slika 3c).Da bi se utvrdilo da li DARS-AS1 stupa u direktnu interakciju sa PACT-om u odsustvu bilo koje druge ćelijske komponente, izvedena je in vitro analiza interferometrije biosloja (BLI) korištenjem pročišćenog PACT-a.Biotinom označeni DARS-AS1 ili lažna RNA imobilizirana je na streptavidin (SA) biosenzorima i zatim inkubirana u kinetičkom puferu koji sadrži 1 μM PACT.Posebno, PACT se snažno vezao za DARS-AS1 (vrijednost KD ~26,9 nM), ali ne i za oponašanje RNK (slika 3d).Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju direktnu interakciju i visok afinitet između DARS-AS1 i PACT.
Analiza povlačenja RNA identifikovala je DARS-AS1 interakciju sa PACT-om u ćelijama SW620.Iznad, srebrno bojenje srodnih proteina.Urađeni su niži imunoblotovi sa anti-PACT antitijelima.b RNA pull-down analiza izvedena je u ćelijama HCT116 (gore) i HepG2 (dole).PACT obogaćivanje je otkriveno imunoblotingom.CRNA imunoprecipitacija (RIP) testovi su izvedeni u SW620 ćelijama koristeći navedena antitijela.d PACT krive vezivanja za DARS-AS1 pune dužine ili kontrolnu RNK dobijene su korištenjem bioslojne interferometrije (BLI).RNK je imobilizirana na streptavidin biosenzoru.1 μM PACT je korišten za mjerenje povezanosti.e Test povlačenja RNA izveden je korištenjem biotiniliranog DARS-AS1 pune dužine ili skraćenog (gore).Imunoblot koji pokazuje primljen PACT (dole).f Prečišćeni označeni PACT inkubiran je sa biotiniliranim DARS-AS1 pune dužine ili skraćen (kao u e) za in vitro RIP test.Ekstrahirana RNK je verifikovana RT-qPCR.g Relativni afinitet različitih RNA fragmenata za PACT dobijen je korišćenjem bioslojne interferometrije.Za analizu je korišteno 100 nM RNK i 1 μM RAST.h In vitro RIP testovi su izvedeni korišćenjem prečišćenog intaktnog ili skraćenog označenog PACT-a.Ekstrahirana RNK je verifikovana RT-qPCR.i Stopa rasta SW620 ćelija koje prekomjerno eksprimiraju DARS-AS1, PACT ili oboje.j Prekomjerna ekspresija pune dužine ili skraćenog DARS-AS1 u SW620 ćelijama imala je različite efekte na rast ćelija.k Apoptoza je otkrivena imunoblotingom sa anti-PARP antitelom.l Nokautiranje DARS-AS1 indukuje apoptozu ćelija SW620 kao što je prikazano protočnom citometrijom.Prikazani podaci su srednja vrijednost ± standardna devijacija tri eksperimenta. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, dvostranim Studentovim t testom. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, dvostranim Studentovim t testom. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 po dvustoronnom kriterijumu Stʹûdenta. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 dvostranim Studentovim t-testom. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, 通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, 通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 po dvustoronnom kriterijumu Stʹûdenta. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 dvostranim Studentovim t-testom.
Zatim smo generisali tri biotinilirana DARS-AS1 RNA fragmenta in vitro transkripcijom da identifikujemo DARS-AS1 region potreban za PACT asocijaciju (slika 3e).Rezultati RNK analize su pokazali da je svaki fragment bio u stanju da stupi u interakciju sa PACT-om, ali 3′-terminalni region (384-768 nukleotida označenih A3) pokazao je više od 1-384 nukleotida označenih A1) (slika 3e).Slični rezultati su uočeni u in vitro RIP testu koristeći rekombinantni PACT (Slika 3f).U skladu s ovim rezultatima, eksperimenti vezanja imobiliziranih RNA fragmenata za PACT korištenjem BLI također su pokazali da PACT ima veći afinitet za A3 (384–768 nt) (vrijednost KD od približno 94,6 nM), dok gotovo da nema veza s drugim područjima.(Sl. 3d).
Također smo ispitali povezane regije vezivanja u PACT-u.PACT sadrži tri funkcionalna domena, od kojih su dva konzervirana dvolančana RNA-vezujuća domena (dsRBD) i treća domena (označena kao D3) koja djeluje kao aktivator proteinskih interakcija.Da bismo ispitali kapacitet vezivanja lncRNA svake domene, napravili smo tri mutacije koje su uklonile svaki od tri domena i izveli in vitro RIP test.Naši rezultati su pokazali da je brisanje treće domene (D3) PACT značajno smanjilo njegovu interakciju sa DARS-AS1 (za 0,11 puta u poređenju sa intaktnim PACT) u poređenju sa druge dve mutacije (slika 3h), pokazalo se da oslobađanje od D3 je u interakciji sa DARS-om.-AC1.Uzeti zajedno, ovi rezultati sugeriraju da se interakcija između DARS-AS1 i PACT može dogoditi prvenstveno preko 3′ kraja DARS-AS1 i D3 domene PACT-a.
Primijetili smo da DARS-AS1 nije imao utjecaja na ekspresiju PACT, a PACT nije imao utjecaja na DARS-AS1 (dodatna slika 3c).Zatim smo ispitali efekat PACT nokdauna na rast ćelija.Za razliku od DARS-AS1, relativne ćelije su rasle 1,5-3 puta brže kada je PACT oboren (dopunska slika 3d).Rezultati testa formiranja kolonija pokazali su da su ćelije formirale 2-3 puta kolonije nakon tretmana shRNA sa PACT (dodatna slika 3e).Da bismo testirali da li DARS-AS1 reguliše proliferaciju ćelija putem PACT-a, generisali smo SW620 ćelije koje prekomerno eksprimiraju PACT, DARS-AS1 ili oboje.Prekomjerna ekspresija PACT-a pokazala je značajnu inhibiciju proliferacije ćelija (Slika 3i).Dok je prekomjerna ekspresija DARS-AS1 sama po sebi značajno promovirala ćelijsku proliferaciju, nije bilo značajne razlike u stopi rasta ćelija koje su prekomjerno eksprimirale DARS-AS1 i PACT.Ovi rezultati sugeriraju da PACT može suprotstaviti povećanu proliferaciju uzrokovanu prekomjernom ekspresijom DARS-AS1.
Budući da različiti regioni DARS-AS1 imaju različite sposobnosti vezanja PACT-a, istražili smo njihov relativni uticaj na proliferaciju ćelija različitom prekomernom ekspresijom DARS-AS1 fragmenata.U poređenju sa druga dva fragmenta, DARS-AS1 je bio prekomerno eksprimiran na 3′ kraju (384–768 nt), glavnom regionu vezanom za PACT u DARS-AS1, koji je imao najveću sposobnost da stimuliše ćelijsku proliferaciju (slika 3j).Ovi rezultati ukazuju na pozitivnu korelaciju između kapaciteta vezivanja i biološke funkcije DARS-AS1.
Izvještava se da je PACT pro-apoptotički protein19.Stoga smo istraživali učinak DARS-AS1 na apoptozu.Kao što se i očekivalo, DARS-AS1 knockdown značajno je povećao PARP cijepanje u SW620 ćelijama i povećao udio aneksin V-pozitivnih ćelija u SW620, HCT116, HepG2 i MBA-MD-231 ćelijskim linijama (slika 3k).3).3f-h), što ukazuje da je anti-apoptotički efekat DARS-AS1 u ćelijama raka suprotan funkciji PACT-a koja indukuje apoptozu.Uzeti zajedno, ovi rezultati sugeriraju da mehanizam DARS-AS1 onkogene funkcije može biti kroz inhibiciju PACT funkcije.
Zatim smo istražili funkcionalne implikacije asocijacije DARS-AS1-PACT.Prijavljeno je da PACT aktivira PKR kroz direktnu interakciju, koja potom pojačava fosforilaciju eIF2α, uzrokujući translacionu deleciju i apoptozu17.Prvo smo ispitali da li DARS-AS1 utječe na ćelijsku lokalizaciju PACT-a i PKR-a.Konfokalna fluorescentna mikroskopija je pokazala da su PACT i PKR bili visoko kolokalizirani u SW620 ćelijama sa prosječnim Pearsonovim koeficijentom korelacije od 0,72.U međuvremenu, prekomjerna ekspresija DARS-AS1 značajno je smanjila PACT i PKR ko-lokalizaciju (srednji Pearsonov koeficijent korelacije 0,61) (Slika 4a).Da bismo istražili da li DARS-AS1 može modulirati PACT-PKR interakciju, izveli smo test ko-imunoprecipitacije (co-IP) sa anti-PACT antitijelom u SW620 ćelijskim lizatima.PKR je bio visoko obogaćen anti-PACT u kontrolnim ćelijama, dok je oporavak PKR značajno smanjen u lizatima iz ćelija koje prekomerno eksprimiraju DARS-AS1 (slika 4b).Pročišćeni označeni PACT i PKR korišćeni su za in vitro testove vezivanja proteina.Shodno tome, oni koji su dali DARS-AS1, ali nisu imali kontrolnu RNK, pokazali su potisnutu interakciju PACT-PKR (Slika 4c).Svi rezultati su pokazali da je DARS-AS1 poremetio PACT i PKR komunikaciju.
Ko-lokalizacija PACT-a i PKR-a u kontrolnim ćelijama ili ćelijama koje prekomerno eksprimiraju DARS-AS1 primećena je korišćenjem konfokalne fluorescentne mikroskopije.Jezgra su obojena DAPI.Statistički rezultati dobijeni su na 16 fotografija.b Ko-imunoprecipitacija (co-IP) upotrebom anti-PACT antitela u ćelijskim lizatima kontrolnih ćelija SW620 ili ćelija koje prekomerno eksprimiraju DARS-AS1.c Obeleženi PACT, prečišćeni PKR i transkribovani in vitro sa DARS-AS1 ili lažnom RNK su inkubirani za in vitro analizu vezivanja proteina.Anti-flag antitijela su korištena za imunoprecipitaciju.d Imunoblotovi sa naznačenim antitelima izvedeni su u ćelijama SW620 i HCT116 transfektovanim kontrolnom shRNA ili DARS-AS1-shRNA nakon čega je usledilo gladovanje u serumu.Nivoi ekspresije DARS-AS1 promijenili su ćelijsku osjetljivost na tapsigargin.SW620 ćelije su transficirane sa DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 plazmidom prekomerne ekspresije ili kontrolnim plazmidom.Ćelije su tretirane tapsigarginom tokom 48 sati, a vitalnost ćelija je određena pomoću MTS reagensa.f In vitro transkribovani DARS-AS1 ili lažna RNA i prečišćeni PACT korišćeni su za in vitro test aktivacije i imunoblot detekciju.g Imunoblotovi pomoću ovih antitela su izvedeni na SW620-ctrl ćelijama (levo) ili ćelijama koje prekomerno eksprimiraju PKR mutante (desno).Ove ćelije su zatim transficirane kontrolnom shRNA ili DARS-AS1-shRNA nakon čega je uslijedilo gladovanje u serumu.h Protočna citometrija je pokazala da je inaktivacija mutantnog PKR kompenzirala DARS-AS1 indukovanu apoptozu u SW620 ćelijama.i Imunoblotovi sa naznačenim antitelima su izvedeni u ćelijama SW620 (levo) ili HCT116 (desno).Ćelije transficirane kontrolnom shRNA ili DARS-AS1 shRNA su lišene seruma i dopunjene su 100 nM inhibitorom PKR C16 ili DMSO.Skala bar = 5 µm.Prikazani podaci su srednja vrijednost ± standardna devijacija tri eksperimenta.* p ≤ 0,05 dvostrani Studentov t-test.
Općenito se vjeruje da kada PACT stupi u interakciju s PKR17, može se inducirati fosforilacija PKR na Thr451.Naši rezultati su pokazali da je nivo fosforilacije PKR značajno povišen u DARS-AS1 knockdown ćelijama nakon gladovanja u serumu (slika 4d i dodatna slika 4a).U skladu s tim, otkrili smo da je fosforilacija eIF2α, glavnog PKR supstrata, također značajno povećana DARS-AS1 shRNA (slika 4d i dodatna slika 4a).Thapsigargin je ER stresor koji uzrokuje da ER oslobađa Ca2+.Prijavljeno je da tretman thapsigarginom indukuje ekspresiju i aktivaciju PACT-a, koji dalje stupa u interakciju sa i aktivira PKR, što dovodi do apoptoze povećanjem fosforilacije eIF2α 18,61.Ovdje smo koristili thapsigargin kao stimulator PACT/PKR puta kako bismo istražili može li DARS-AS1 pomoći ćelijama da prevladaju stres inhibirajući PACT/PKR put.Uočili smo da je nivo ekspresije DARS-AS1 u pozitivnoj korelaciji sa rezistencijom ćelija na tapsigargin.SW620 ćelije sa prekomernom ekspresijom DARS-AS1 bolje su preživele kada su tretirane tapsigarginom, dok su ćelije sa oborenim DARS-AS1 postale osetljivije (slika 4e).U skladu s ovim rezultatima, prekomjerna ekspresija DARS-AS1 smanjila je fosforilaciju PKR izazvanu tapsigarginom (dopunska slika 4b).Nasuprot tome, nakon tretmana tapsigarginom, PKR i eIF2α su fosforilirani u većoj mjeri u DARS-AS1 knockdown ćelijama u odnosu na kontrolne ćelije (dodatna slika 4b).Zanimljivo je da je thapsigargin inducirao ekspresiju DARS-AS1 na način ovisan o dozi, što može ukazivati ​​na antistresnu funkciju DARS-AS1 (dopunska slika 4c).Osim toga, izvršili smo in vitro testove aktivacije da potvrdimo ova zapažanja.Ukratko, PKR je pročišćen iz ćelijskih lizata upotrebom anti-PKR antitela, a zatim inkubiran sa rekombinantnim PACT i DARS-AS1 transkribovanim in vitro.Nakon enzimske reakcije, fosfo-PKR je detektovan pomoću WB.Naši rezultati su pokazali da je fosforilaciju PKR značajno inhibirao DARS-AS1, ali ne i kontrolna RNK (Slika 4f).Ovi in ​​vitro i in vivo rezultati ukazuju na to da DARS-AS1 inhibira PACT posredovanu aktivaciju PKR.U isto vrijeme, također smo primijetili smanjenje PACT oporavka u prisustvu DARS-AS1 (Slika 4f).Ovaj rezultat je u skladu sa rezultatima in vitro testa vezivanja proteina (Slika 4c) i ponovo ilustruje funkciju blokiranja DARS-AS1 za PACT-PKR povezanost.
Ser246 i Ser287 u D3 domeni PACT-a su potrebni za aktivaciju PKR-a pod ćelijskim stresom.Zamjena dva serinska ostatka za alanin dala je mutant PACT (mutD), koji je aktivirao PKR u odsustvu stresa, a zamjena za alanin (mutA) je preokrenula protokol.Pošto smo pokazali važnost ovog domena u direktnoj povezanosti sa DARS-AS1, generisali smo ova dva PACT mutanta kako bismo testirali da li ovi ostaci takođe mogu biti uključeni u interakciju sa DARS-AS1.Zanimljivo je da su oba mutanta izgubila sposobnost vezivanja za DARS-AS1 (dopunska slika 4d), što sugerira da bi kompletna struktura PACT proteina mogla biti potrebna za efikasnu interakciju sa DARS-AS1.
Nadalje, naši rezultati također sugeriraju da se inhibicija proliferacije stanica izazvana DARS-AS1-shRNA može djelomično obnoviti prekomjernom ekspresijom dominantnog negativnog PACT mutanta (PACTmutA) ili dominantnog negativnog PKR mutanta (PKRmut) (dodatna slika 4e. e).Prekomjerna ekspresija dominantno-negativnih PKR mutanata smanjila je fosforilaciju PKR izazvanu DARS-AS1 nokdaunom, kao i fosforilaciju eIF2α u ćelijama lišenim seruma (Slika 4g).Što je još važnije, udio apoptotičkih ćelija induciranih DARS-AS1 nokdaunom također je smanjen u stanicama koje prekomjerno eksprimiraju PKRmut (slika 4h i dodatna slika 4g).Inhibicija aktivnosti PKR kinaze također narušava funkciju DARS-AS1, jer su rezultati pokazali da DARS-AS1 nokdaun rijetko pokreće fosforilaciju PKR i eIF2α kada su ćelije tretirane PKR-specifičnim inhibitorom C16 (slika 4i i dodatna slika 4h).).Uzeti zajedno, naši rezultati sugeriraju da DARS-AS1 promovira proliferaciju stanica, barem djelomično, inhibirajući PACT posredovanu aktivaciju PKR.
Da bismo dalje istražili ulogu DARS-AS1 u tumorigenezi, izveli smo in vivo eksperimente koristeći model mišjeg ksenografta. Rezultati pokazuju da je nokdaun DARS-AS1 dramatično smanjio rast tumora kod miševa (p vrijednost < 0,0001) (slika 5a). Rezultati pokazuju da je nokdaun DARS-AS1 dramatično smanjio rast tumora kod miševa (p vrijednost < 0,0001) (slika 5a). Rezultati pokazuju da je nodaun DARS-AS1 rezko snižen u dubinu miša (značenje p <0,0001) (ris. 5a). Rezultati pokazuju da nokdaun DARS-AS1 drastično smanjuje rast tumora kod miševa (p vrijednost < 0,0001) (Slika 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长 (p 值< 0,0001) (图5a)结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长 (p值<0,0001) (囀5a) Rezultati su pokazali da je nodaun DARS-AS1 značajno smanjen u porastu u mišu (značenje r <0,0001) (ris. 5a). Rezultati su pokazali da nokdaun DARS-AS1 značajno smanjuje rast tumora kod miševa (p vrijednost < 0,0001) (Slika 5a).Dakle, u DARS-AS1 knockdown grupi, došlo je do značajnog smanjenja srednjeg volumena tumora za oko 72,9% i srednje mase tumora za oko 87,8% (Slika 5b-d).Ovi rezultati snažno sugeriraju da DARS-AS1 može značajno promovirati rast tumora in vivo.
Efekti obaranja ad DARS-AS1 na kolorektalnu onkogenezu kod golih miševa.Prikazane su krive rasta (a), veličina tumora (b), težina (c) i slike tumora (d).Trake grešaka predstavljaju ±SEM. n = 10. ****p < 0,0001, dvostranim Studentovim t testom. n = 10. ****p < 0,0001, dvostranim Studentovim t testom. n = 10. ****p < 0,0001 po dvustoronnom kriterijumu Stjudenta. n = 10. ****p < 0,0001 dvostrani Studentov t-test.n = 10. ****p < 0,0001,通过双尾学生t 检验。 ****p < 0,0001,通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 po dvustoronnom kriterijumu Stjudenta. ****p < 0,0001 dvostrani Studentov t-test.e Kaplan-Meier je analizirao korelaciju između nivoa ekspresije DARS-AS1 i ukupnog preživljavanja kod pacijenata sa UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM i LGG.Visoki nivoi ekspresije DARS-AS1 kod pacijenata bili su u prvih 50%;nizak nivo ekspresije DARS-AS1 kod pacijenata bio je u donjih 50%.p-vrijednosti su određene korištenjem log rank testa.f Predloženi model u kojem DARS-AS1 reguliše PACT-PKR put i rast tumora.
Da bismo bolje razumjeli klinički utjecaj DARS-AS1, ispitali smo korelaciju između njegove ekspresije i preživljavanja pacijenata.Analizom TCGA skupa podataka, otkrili smo da je veća ekspresija DARS-AS1 povezana sa uvealnim melanomom (UVM), renalnom hromofobijom (KICH), karcinomom papilarnih ćelija bubrega (KIRP), mezoteliomom (MESO), multipleksom.Niže preživljavanje je značajno povezano sa morfozom glioblastoma (GBM) i pacijentima sa niskim stepenom glioma mozga (LGG) (Slika 5e).Ovi rezultati sugeriraju da DARS-AS1 može igrati važnu ulogu u kliničkoj progresiji tumora i može biti potencijalni prediktivni biomarker kod višestrukih karcinoma.
U ovoj studiji, koristeći CRISPRi funkcionalni skrining velikih razmjera, utvrdili smo da DARS-AS1 lncRNA prevladava stres ćelija raka regulacijom dva ključna odgovora na stres, PACT i PKR.Direktnom interakcijom sa PACT-om, DARS-AS1 je inhibirao PACT posredovanu aktivaciju PKR-a, čime je spriječio apoptotičku ćelijsku smrt i promovirao ćelijsku proliferaciju (slika 5f).Povećana regulacija DARS-AS1 je primijećena kod više vrsta karcinoma, što sugerira da njegova funkcija promicanja preživljavanja stanica raka u stresnim uvjetima može biti široko primjenjiva na više vrsta raka.
PACT je identificiran kao protein aktivator PKR, a PACT posredovana aktivacija PKR igra važnu ulogu u odgovorima na stres regulacijom transkripcije, translacije, apoptoze i drugih važnih ćelijskih procesa62.Decenijama su se pokušavali razumjeti specifična regulacija PACT-PKR kaskade.Ovdje je naša studija otkrila drugačiji mehanizam regulacije PACT-PKR u ćelijama raka putem ćelijske lncRNA DARS-AS1, koja se direktno vezuje za PACT, blokira PACT-PKR interakciju, inhibira PKR aktivaciju i fosforilaciju eIF2α, čime inhibira apoptozu izazvanu stresom i stimulisanje eventualne proliferacije raka.ćelije.Ovo otkriće baca svjetlo na potencijalne mete lncRNA za prognozu i terapiju raka.
Naši podaci su pokazali da DARS-AS1 knockdown senzibilizira ćelije na gladovanje u serumu uz značajno povećanje fosforiliranog PKR i eIF2α.Ovi rezultati ukazuju na to da DARS-AS1 promoviše preživljavanje ćelija raka u teškim uslovima inhibiranjem PACT/PKR aktivnosti.Nekoliko drugih nekodirajućih RNK, kao što su ASPACT i nc886, također su uključeni u PACT/PKR os tako što smanjuju mRNA PACT48 ili regulišu autofosforilaciju vezivanjem za PKR49,50,64.Među njima, DARS-AS1 djeluje kao ometač PACT-PKR asocijacije.Ova studija obogaćuje naše razumijevanje regulacije osovine PACT/PKR i uloge lncRNA u odgovorima na stres.
PACT sadrži tri odvojena domena.Svaki od prva dva dsRBD-a dovoljan je za postizanje visokog afiniteta vezanja PACT-a za PKR, dok je treći domen (D3) potreban za aktivaciju PKR in vitro i in vivo.Naša studija je pokazala da DARS-AS1 preferencijalno interaguje sa D3 domenom (slika 3h).S obzirom na veliku veličinu lncRNA (768 nukleotida), vezivanje DARS-AS1 za D3 može fizički inhibirati interakciju između PACT domena dsRBD i PKR, čime se blokira povezanost PACT i PKR.PACT tačkaste mutacije koje su zamijenile Ser246 i Ser287 u D3 alaninom ili aspartatom poremetile su njegov afinitet vezivanja za DARS-AS1, ukazujući na važnost ukupnih strukturnih i električnih svojstava D3 u njihovoj povezanosti.Dalji detalji o ovom mehanizmu biće potrebni u budućnosti, koristeći precizniju biohemijsku analizu i PACT strukturnu analizu visoke rezolucije.
Prethodne studije su objavile da DARS-AS1 promoviše proliferaciju ćelija kroz nekoliko mehanizama51,52,53.U jednom primjeru, istraživači su primijetili da DARS-AS1 pojačava regulaciju svog DARS gena koji kodira antisens protein ciljajući miP-194-5p u stanicama raka bubrega.Međutim, u ovoj studiji, nokdaun DARS-AS1 je imao mali učinak na DARS transkripciju kod više vrsta karcinoma, uključujući barem kolorektalni karcinom, rak dojke i jetre.Budući da lncRNA pokazuju obrasce ekspresije specifične za ćeliju i tkivo, funkcionalni mehanizmi možda neće biti očuvani među tipovima raka, što može doprinijeti ovom neskladu između naših zapažanja i prethodnih procjena različitih karcinoma.Potrebne su posebne studije da bi se razjasnili specifični mehanizmi različitih fizioloških i patoloških procesa.
Analiza kliničkih podataka pokazala je da je ekspresija DARS-AS1 u tumorima u obrnutoj korelaciji sa preživljavanjem pacijenata oboljelih od raka, što naglašava značaj DARS-AS1/PACT/PKR ose u prognozi raka.Zaključno, naša studija pokazuje da je DARS-AS1 regulator PACT/PKR signalne ose, promoviše proliferaciju ćelija raka i inhibira apoptozu tokom odgovora na stres, što predstavlja još jednu liniju istraživanja i od interesa je za buduća istraživanja potencijalnih tretmana. .
Ljudske ćelijske linije SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 i HEK293T su dobijene od Nacionalne infrastrukture ćelijskih linija u Kini.Sve ćelije su održavane u medijumu DMEM (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) sa dodatkom 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) i 1% penicilin-streptomicina (Thermo Fisher Scientific) na 37°C, 5% CO2.inkubator.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (phospho-T451), Abcam (ab81303);Anti-Flag, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764)) ;anti-eIF2α (fosfor S51), Abcam (ab32157);anti-PACT (fosfor S246), Abgent (AP7744b);anti-β-tubulin, CST (2128);normalan mišji IgG, CST (5415S);normalan zečji IgG, CST (2729S).Antitijela su razrijeđena 1:1000 u PBST za Western blotting i 1:100 za IP.
sgRNA su razvijene korištenjem javno dostupnog alata pod nazivom CRISPR-ERA66.Koristili smo zadane parametre alata za razvoj sgRNA, a algoritam je izračunao mjesta vezivanja sgRNA u regiji od 3 kb.sa središtem u TSS.Skupovi sgRNA oligonukleotida su sintetizirani u CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) i klonirani u humanizirane pgRNA plazmide (Addgene #44248).Ukupno 12 µg spojenog humaniziranog pgRNA plazmida, 7,2 µg psPAX2 (Addgene #12260) i 4,8 µg pMD2.G (Addgene #12259) je ko-transficirano u 5 x 106 HEK293T difuznih uzoraka u DNA cm transfectu ćelije ( CWBIO, Peking, Kina) prema uputama proizvođača.Supernatanti koji sadrže virus su sakupljeni 48 i 72 sata nakon transfekcije i filtrirani kroz filter od 0,45 µm.Za skrining, SW620 ćelije koje eksprimiraju dCas9/KRAB fuzioni protein su dobijene transdukcijom virusa.Modifikovane ćelije SW620 su inficirane bibliotekom virusa u četiri nezavisna eksperimenta infekcije pri MOI od 0,1-0,3 i uzorkovane su sa 2 μg/ml puromicina (Sigma, St. Louis, MO) tokom 2 dana.Nakon toga, ćelije su kultivisane 18 dana in vitro sa minimalnom pokrivenošću biblioteke od 500 ćelija/sgRNA za skrining.
Genomska DNK je ekstrahovana prema uputstvima QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, Njemačka; 51183).Ukupno, 100 μg genomske DNK po biološkom ponavljanju je korišteno za izgradnju biblioteke.Regija sgRNA je amplificirana u dva kruga PCR-a i povezana sa barkodom.
PCR proizvodi su pročišćeni upotrebom NucleoSpin® gela i kompleta za PCR prečišćavanje (MACHEREY-NAGEL, Düren, Njemačka; 740609.250) i kvantificirani korištenjem Qubit™ HS dvolančanog DNK kompleta za detekciju (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
MTS test je korišten za mjerenje proliferacije ćelija.Ćelije su posađene u ploče sa 96 jažica pri početnoj gustini od 2000 ćelija/jažici.Relativni broj ćelija je meren dnevno u naznačeno vreme tokom ukupno 4-6 dana.Za svaku jažicu, 20 μl MTS reagensa (Promega) je razblaženo sa 100 μl DMEM, inkubirano sa ćelijama 4 h na 37°C, a zatim je izmeren OD490.
Sposobnost neusiđenog rasta otkrivena je analizom formiranja sfera.Ukratko, 2000 ćelija transficiranih sa shRNA DARS-AS1 ili kontrolnom shRNA kultivisano je u mikropločama sa ultra niskim pričvršćivanjem (Corning) sa promjenom medija svaka 4 dana.Sferoidi su prebrojani nakon 14 dana.500 ćelija transficiranih plazmidom prekomerne ekspresije DARS-AS1 ili kontrolnim plazmidom korišćeno je za ispitivanje poboljšanja, inače je metoda ostala nepromenjena.
RNA je transkribovana upotrebom T7 RNA polimeraze i biotin-16-UTP (Roche 1138908910) prema uputstvima Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).Prajmeri koji se ovdje koriste navedeni su u dodatnoj tabeli 4.
PACT ili PKR regioni koji kodiraju protein klonirani su u pET15b (Addgene #73619) i transformisani u BL21(DE3).Bakterije su inkubirane preko noći u LB opskrbljenom ampicilinom, a zatim razrijeđene 100 puta svježim LB.Kada je OD600 medijuma dostigao 0,8, dodat je 1 mM IPTG da bi se indukovala ekspresija proteina.Nakon inkubacije preko noći uz lagano mućkanje (250 rpm na 20°C), ćelijska peleta je sakupljena centrifugiranjem (4000 rpm, 10 min, 4°C).Resuspendirajte ćelijsku peletu u puferu za lizu (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) i inkubirajte na ledu 30 minuta, zatim sonikirajte (15 minuta, 5 s uključeno/isključeno, na ledu) i centrifugirajte (13 000 rpm)., 30 min, 4°S).Supernatant je zatim stavljen na Ni-NTA smolu (QIAGEN) 3 puta na 4°C, ispran 4 puta puferom za ispiranje (50 mM Tris, pH 8,0, 40 mM imidazola, 250 mM NaCl) i eluiran 3 puta, sa ukupnim od 10 ml eluentnog pufera (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 300 mM imidazola).Pročišćeni protein je određen korištenjem WB, a koncentracija je određena korištenjem Qubit™ kompleta za analizu proteina (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
RIP testovi su izvedeni kao što je prethodno opisano, uz modifikacije.Ukratko, 1x RIP pufer (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5% NP-40, RNasin inhibitor ribonukleaze (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, proteaza) lizira 1 x 17 cytostatic0 (Roche, 1 mM DTT) i centrifugirajte na 13.000 o/min 15 minuta na 4 °C.Supernatant je zatim inkubiran sa proteinskim A+G magnetnim zrncima (Millipore) konjugiranim sa 5 μg anti-PACT antitijela (Abeam) ili IgG (CST).Zrnca su isprana 5 puta sa 5x RIP puferom, zatim digestirana proteinazom K (NEB).RNK je ekstrahovana sa Trizolom i određena pomoću RT-qPCR.Prajmeri su predstavljeni u Dodatnoj tabeli 5.
In vitro RIP test je izveden prema modifikovanom standardnom protokolu RIP testa.Ukupno 5 pmol in vitro transkribovane RNK razrijeđeno je 1x sa RIP puferom i žareno inkubacijom na 65°C tokom 5 minuta nakon čega je slijedilo polagano hlađenje na sobnu temperaturu.Ukupno 5 pmol intaktnih ili mutiranih PACT proteina označenih zastavicom je pročišćeno iz E. coli.Inkubirajte sa renaturisanom RNK 2 sata na 4°C i slijedite gornju proceduru za RIP analizu za anti-flag IP.
Za analizu proširenja RNK, 1×107 ćelija je lizirano sa 1xRIP puferom.Nakon centrifugiranja na 13.000 rpm u trajanju od 15 minuta na 4°C, supernatant je prethodno tretiran sa 30 μl magnetnih kuglica streptavidina (Beckman) 2 h na 4°C.Pročišćeni lizat je zatim dodan tRNA kvasca i inkubiran sa 40 pmol renaturisane RNK preko noći na 4°C, zatim još 2 sata i dodano je 20 μl novih streptavidin magnetnih kuglica blokiranih BSA.Korak pranja sastojao se od 4 puta sa 5x RIP puferom i 4 puta sa 1x RIP puferom.Odgovarajući proteini su eluirani biotinskim elucijskim puferom (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 12,5 mM D-biotin, PMSF) i razdvojeni na NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gelu (Invitrogen).Nakon bojenja srebrom (Beyotime Biotechnology), određene trake su izrezane i analizirane MS.
Co-IP analiza je izvršena da bi se testirala interakcija između PACT-a i PKR-a.Ukratko, supernatantni lizati su pripremljeni inkubacijom 1 x 107 liziranih ćelija u 1 x RIP puferu nakon čega je uslijedilo centrifugiranje na 13.000 rpm tokom 15 minuta na 4°C.Lizati su napunjeni magnetnim zrncima proteina A + G, konjugirani sa 5 µg anti-PACT antitijela i lagano rotirani preko noći na 4°C.Perle su isprane 3 puta sa 5×RIP puferom, dva puta sa 1×RIP puferom i eluirane sa 1×SDS puferom.Dobijeni protein je analiziran SDS-PAGE gelom i detektovan pomoću WB.
Dva pmol označenog PACT i 1 pmol PKR su pročišćeni iz E. coli.Razblažite u 1× RIP puferu i inkubirajte sa 10 pmol renaturisane RNK 2 sata na 4 °C.Nakon toga, inkubirani su sa anti-obilježenim antitijelom konjugiranim s proteinom A+G magnetnim kuglicama još dva sata.Zrnca su zatim isprana četiri puta sa 1x RIP puferom i eluirana sa 1x SDS puferom.Rezultirajući PACT i PKR detektovao je WB.